邱智軍，原江鋒，張國慶，劉勝男

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023；2.三門峽出入境檢驗檢疫局，河南 三門峽 472000）

連翹葉中連翹苷和連翹酯苷A對食用油脂的抗氧化活性

邱智軍1,2，原江鋒1，張國慶2，劉勝男2

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023；2.三門峽出入境檢驗檢疫局，河南 三門峽 472000）

針對連翹葉中提取、分離和純化的連翹苷和連翹酯苷A進行研究，通過油脂抗氧化實驗，分別以油脂的酸價值和過氧化值為參考指標(biāo)，評價連翹苷和連翹酯苷A的抗氧化活性和VC、檸檬酸對連翹苷和連翹酯苷A的協(xié)同增效作用。結(jié)果表明：制備得到純度為93%連翹苷和92%連翹酯苷A，連翹苷和連翹酯苷A對豬油氧化作用均有一定的抑制作用，且隨著劑量的增加，抑制效果越明顯；其中，連翹酯苷A對油脂氧化的抑制作用遠優(yōu)于連翹苷，效果與陽性對照2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚接近；VC和檸檬酸對連翹苷和連翹酯苷A的抗氧化作用均表現(xiàn)出協(xié)調(diào)增效作用。

連翹苷；連翹酯苷A；食用油脂；抗氧化

油脂是人體必需的三大營養(yǎng)素之一，油脂以及含油豐富的食品在不適宜的貯藏條件下儲存時間過長或使用不當(dāng)，很容易發(fā)生酸敗[1]，導(dǎo)致人體必需脂肪酸和脂溶性維生素的破壞，營養(yǎng)價值降低[2]，其本質(zhì)是不飽和脂肪酸與氧之間發(fā)生的典型的自由基連鎖反應(yīng)[3-5]?？寡趸瘎┠軌蚍乐够蜓泳徥称烦煞职l(fā)生氧化變質(zhì)。合成抗氧化劑，如丁基羥基茴香醚、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）、沒食子酸丙酯、特丁基對苯二酚等，耐熱性較差，熔點及沸點都較低，經(jīng)過加熱特別是在油炸等較高溫度下很容易分解或揮發(fā)，另外其還具有一定的毒性，甚至對人體有致畸、致癌作用[6-7]。因此，開發(fā)利用天然抗氧化劑已成為當(dāng)今食品科學(xué)的發(fā)展趨勢[8-13]。連翹是一種具有很高利用價值的藥食兩用植物，其提取物具有抗氧化、抑菌消炎、抑制病毒等活性作用[14-19]。研究表明[20]，連翹葉提取物有明顯的抗氧化作用，連翹苷和連翹酯苷A是其中兩種主要的高效抗氧化功能組分。與連翹果實相比，連翹葉中連翹苷含量高于連翹果實約10倍以上，連翹酯苷A含量高于連翹果實5～10倍[21]。連翹作為一種天然食品防腐劑，其具有價格低廉，對食品風(fēng)味影響小等特點，極具開發(fā)價值[15]。本實驗將對連翹苷和連翹酯苷A在食用油脂中的抗氧化活性進行研究，以期為以后的應(yīng)用開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

連翹葉：2013年7月采自河南豫西伏牛山地區(qū)連翹種植基地，經(jīng)河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院侯小改教授鑒定為木犀科植物連翹（Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl）的干燥葉。

油脂：新鮮豬油為市售板油；連翹酯苷A（批號：111810-201405，純度＞91.4%）、連翹苷（批號：110821-201213，純度＞95.3%） 中國食品藥品檢定研究所；BHT（食品級） 上海凱茵化工有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；BS 124S型萬分之一天平、PB-310S型分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海實驗儀器廠；恒溫水浴鍋常州國華電器有限公司；723型紫外分光光度計 上海第三分析儀器廠；TL00-200M蠕動泵 無錫市天利流體工業(yè)設(shè)備廠。

1.3方法

1.3.1連翹苷和連翹酯苷A的制備

將40 g粉碎連翹葉用1 200 mL體積分數(shù)55%的乙醇74℃浸提50 min，過濾，提取2次，合并濾液，50℃減壓濃縮回收乙醇，得濃縮液665 mL，加入35 mL無水乙醇，得到含體積分數(shù)5%乙醇的連翹葉提取液。將連翹葉提取液用2.6 cm×25 cm的AB-8樹脂柱吸附，分別用30%和50%乙醇的洗脫，得到連翹葉提取物Ⅰ和連翹葉提取物Ⅱ。連翹葉提取物Ⅰ濃縮、靜置沉淀；用100%乙醇重新結(jié)晶3次，得到純的化合物Ⅰ。連翹葉提取物Ⅱ用水飽和正丁醇萃取3次，回收正丁醇，干燥，得粗品；粗品用30%的甲醇在8 cm×50 cm的C18反相硅膠柱層析分離，收集洗脫液，減壓濃縮得純的化合物Ⅱ。樣品重復(fù)制備5次。

1.3.2色譜條件及檢測方法

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：甲醇（A）-水（含體積分數(shù)0.2%冰醋酸）（B），梯度洗脫：0～3 min，32%～32%A；3～25 min，32%～55%A；25～30 min，55%～55%A，測定波長235 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30℃。

1.3.3油樣的制備

將新鮮購買的豬板油切成約1 cm3小塊，用文火熬制，之后用幾層紗布過濾以除去殘渣，冷卻后密封在-20℃冰箱中保存。

1.3.4酸價的測定

酸價測定具體方法參照GB/T 5009.37—2003《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[22]。

1.3.5過氧化值（peroxide value，POV）的測定

油脂POV測定具體方法參照GB/T 5009.37—2003[22]。

1.3.6連翹苷和連翹酯苷A對豬油抗氧化作用的影響

油脂氧化試驗采用Schaal烘箱法[23]，連翹苷及連翹酯苷A按照豬油質(zhì)量的0.02%、0.04%、0.08%、0.12%分別加入到50 g油脂中，空白油樣作為對照，0.02%的BHT做陽性對照，置于65℃烘箱中，每隔12 h攪拌一次并交換它們在烘箱中的位置，定時（0、5、10、14、18、22 d）檢測每份油樣中的酸價和POV。

1.3.7連翹苷和連翹酯苷A與VC和檸檬酸的協(xié)同抗氧化作用

精確稱取10 mg的VC、檸檬酸、連翹苷和連翹酯苷A，將VC和檸檬酸分別與連翹苷和連翹酯苷A混合溶解：連翹苷+VC、連翹苷+檸檬酸、連翹酯苷A+VC和連翹酯苷A+檸檬酸，將抗氧化劑增效組分別溶解到50 g豬油中，置于65℃烘箱中，每隔12 h攪拌一次并交換它們在烘箱中的位置，定時（0、5、10、14、18、22 d）檢測每份油樣中的酸價和POV。

2 結(jié)果與分析

2.1連翹苷和連翹酯苷A分析

制得0.128 g化合物Ⅰ和2.55 g化合物Ⅱ，化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的提取率分別為0.32%和6.39%。經(jīng)高效液相方法鑒定，化合物Ⅰ和化合物Ⅱ分別為連翹苷和連翹酯苷A，結(jié)果見圖1，通過外標(biāo)法檢測連翹苷和連翹酯苷的純度分別為93%和92%，此樣品作為油脂抗氧化活性使用。

圖1 連翹苷和連翹酯苷A混標(biāo)（a）、連翹酯苷A樣品（b）、連翹苷樣品（c）的高效液相色譜圖Fig.1 Chromatograms of forsythiaside and forsythin in mixed standard solution (a), purified forsythiaside A (b), and purified forsythin (c)

2.2連翹苷和連翹酯苷A對豬油的抗氧化作用

圖2 不同劑量連翹苷（a）和連翹酯苷A（b）對豬油酸價的影響Fig.2 Effect of different doses of forsythin (a) and forsythiaside A (b) on acid value of lard

連翹苷抑制豬油氧化作用的酸價如圖2a所示，連翹苷對豬油的氧化酸敗具有一定的抑制作用，總體趨勢為隨著時間的延長，豬油體系中酸敗越明顯；隨著連翹苷添加量增強，連翹苷抑制酸敗的作用越強。結(jié)果表明，氧化實驗的前10 d，除空白組外各組間的變化差異不大；10 d后各劑量連翹苷表現(xiàn)出抗氧化差異逐漸明顯，但其效果不及陽性對照BHT（P＜0.01）。連翹酯苷A對豬油的抑制效果見圖2b，各組表現(xiàn)趨勢與連翹苷相似，抗酸敗作用呈現(xiàn)劑量依賴性，0.12%連翹酯苷A具有較強的抗氧化功效，效果與0.02%BHT陽性對照相當(dāng)（P＞0.05）。比較連翹苷和連翹酯苷A抗酸敗作用可以看出，連翹酯苷A抗酸敗活性強于連翹苷活性。

圖3 不同劑量連翹苷（a）和連翹酯苷A（b）對豬油POV的影響Fig.3 Effect of different doses of forsythin (a) and forsythiaside A (b) on POV value of lard

油脂暴露在空氣中易氧化形成自由基，自由基繼續(xù)與氧反應(yīng)生成自由基和過氧化物，自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)再使油脂繼續(xù)氧化，可以測定油脂的POV來評價其氧化程度，POV越大，氧化程度就越高。如圖3a所示，連翹苷POV與酸價的變化趨勢相似，隨著時間的延長，POV不斷增加，最大添加量時對油脂抗氧化活性效果最強；隨著添加量連翹苷的增大，抗氧化活性具有劑量效應(yīng)關(guān)系；但與陽性對照BHT相比，連翹苷所顯示的POV增加速率較快，抗氧化能力遠不及BHT（P＜0.01）。

如圖3b所示，連翹酯苷A的POV也是隨著加熱時間的延長而逐漸增加，初期（＜10 d）各處理條件樣品的過氧化值變化均無明顯差異，可能是因為氧化反應(yīng)處于誘導(dǎo)期，自由基初步生成，過氧化物尚未大量生成，表現(xiàn)為過氧化值變化不明顯。14 d以后過氧化物逐漸增加，呈現(xiàn)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的加速期，尤其是空白對照組過氧化值增加加快；連翹酯苷A對豬油的氧化具有較強的抑制作用，當(dāng)添加量為0.12%時與0.02%BHT抗氧化能力較為接近。

從圖2、3的結(jié)果比較還能看出，連翹酯苷A抑制油脂氧化的作用明顯相比連翹苷要強很多，即連翹酯苷A的抗氧化活性具有明顯的優(yōu)勢。

2.3連翹苷和連翹酯苷A與VC和檸檬酸的協(xié)同抗氧化作用

某些有機酸與抗氧化劑混合組成復(fù)合抗氧化劑在發(fā)揮抗氧化作用時，各組分間可能發(fā)生一系列復(fù)雜的反應(yīng)，表現(xiàn)協(xié)同增效的作用[24]。本研究選用檸檬酸和VC為增效劑，結(jié)果如圖4a、4b所示，在選用的劑量水平上，復(fù)合抗氧化劑的效果分別優(yōu)于對應(yīng)單獨組分（P＜0.05），在反應(yīng)前期，增效劑檸檬酸和VC的加入沒有明顯抑制油脂酸價和POV的增大，而在反應(yīng)后期增效劑的抑制作用則明顯加強；兩者比較而言，VC對連翹苷和連翹酯苷A的增效作用較強，而檸檬酸的增效作用較弱。

圖4 協(xié)同抗氧化作用對豬油酸價（a）和POV（b）的影響Fig.4 Synergistic effect of forsythiaside A and forsythin with VC or citric acid on acid value(a) and POV value (b) of lard

抗氧化劑的混合使用較單一使用者更為有效，能夠起到相互協(xié)同促進的作用，可能的原因是：VC本身就是一種重要的自由基清除劑，它通過逐漸供給電子而轉(zhuǎn)變成半脫氫抗環(huán)血酸和脫氫VC以達到清除活性氧自由基。VC也能溶于油脂中微量氧發(fā)生氧化還原反應(yīng)從而避免油脂的自動氧化。另外，VC作為酸性物質(zhì)，能夠鈍化油脂中促自動氧化的金屬離子，從而對連翹苷和連翹酯苷A的抗油脂氧化產(chǎn)生協(xié)同增效作用。因此也可以說VC既是抗氧化劑又是增效劑。檸檬酸本身不具有抗氧化性，但是它也屬于酸性物質(zhì)，它對抗氧化劑的增效作用是因為其能與油脂中的金屬離子發(fā)生螯合作用，降低了這些離子的有效濃度，而這些金屬離子能夠縮短鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及引發(fā)期的時間，加快脂類的氧化，檸檬酸的螯合作用使這些金屬離子失去促油脂自動氧化的能力，以表現(xiàn)出對連翹苷和連翹酯苷A的協(xié)同增效作用[25-26]。

3 結(jié) 論

從酸價和POV兩個油脂氧化程度的指標(biāo)來看，連翹苷和連翹酯苷A對油脂均具有抗氧化作用，但連翹酯苷A抗氧化能力更強。連翹苷和連翹酯苷A是從連翹葉中提取制備的天然活性化合物，較人工合成的抗氧化劑（如：BHT）安全性高，毒副作用?。幌啾容^而言，連翹酯苷A更適合用于開發(fā)天然抗氧化劑。

在油脂抗氧化體系中，不同添加量的連翹苷及連翹酯苷A均對豬油有一定的抗氧化作用，而且表現(xiàn)出劑量依賴性，其中連翹酯苷A的抗氧化效果更為顯著。VC和檸檬酸對連翹苷和連翹酯苷A的抗氧化作用都具有明顯的協(xié)同增效作用，混合使用抗氧化劑對豬油的抗氧化效果明顯優(yōu)于單一抗氧化劑的使用效果?？傊?，連翹酯苷A的抗氧化活性明顯高于連翹苷，作為天然抗氧化劑，其又具有好的安全特性，在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域有開發(fā)利用的價值，連翹酯苷A的體內(nèi)抗氧化活性有待于進一步探究。

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Antioxidant Activity of Forsythin and Forsythiaside A from Forsythia suspensa Leaves on Edible Oils

QIU Zhijun1,2, YUAN Jiangfeng1, ZHANG Guoqing2, LIU Shengnan2
(1. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China; 2. Sanmenxia Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Sanmenxia 472000, China)

This study was focused on the antioxidant activity of forsythin and forsythiaside A isolated and purified from leaves ofForsythia suspensa. and the synergistic effect of the two compounds with vitamin C and citric acid as evaluated by acid value and peroxide value (POV) of lard. The results showed that forsythin with purity of 93%and forsythiaside A with purity of 92%were obtained and that both of these compounds had concentration-dependent inhibitory effects on lipid oxidation in lard. The inhibitory effect of forsythiaside A was close to that of the positive control 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) but the inhibitory effect of forsythin on lipid oxidation was far weaker than that of forsythoside A. Both vitamin C and citric acid exhibited remarkable synergistic antioxidant activity with forsythin and forsythiaside A.

forsythin; forsythiaside A; edible oil; antioxidant activity

TS201.2

1002-6630（2015）17-0039-04

10.7506/spkx1002-6630-201517008

2014-11-22

國家自然科學(xué)基金河南人才培養(yǎng)聯(lián)合基金項目（U1404307）；洛陽市科技攻關(guān)項目（1401076A）

邱智軍（1978—），男，副教授，博士，主要從事活性成分的分析和預(yù)測研究。E-mail：qiuzj2003@163.com