大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院泌尿外科，遼寧 大連 116023

檜木醇激活膀胱癌J82細胞自噬誘導(dǎo)細胞凋亡

高玉仁，張德福，王梁，劉志宇

大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院泌尿外科，遼寧 大連 116023

背景與目的：膀胱癌是我國最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來發(fā)病率逐年上升，嚴重威脅著人類的健康。本研究旨在探討檜木醇對人膀胱癌J82細胞增殖、凋亡及自噬的作用，并初步闡明其作用機制。方法：采用CCK-8法檢測細胞的增殖活力，采用流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡狀態(tài)，采用蛋白[質(zhì)]印跡法(Western blot)檢測cleaved caspase 3、LC3及P62蛋白的表達，轉(zhuǎn)染EGFP-LC3后在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞自噬狀態(tài)。結(jié)果：檜木醇能夠顯著抑制J82細胞的增殖活力，通過激活caspase途徑誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，Z-VAD-FMK能夠部分抑制檜木醇的凋亡誘導(dǎo)作用。檜木醇能夠激活J82細胞發(fā)生自噬，上調(diào)LC3蛋白的表達，下調(diào)P62蛋白的表達。3-MA抑制自噬之后能夠部分逆轉(zhuǎn)檜木醇的抗腫瘤作用。結(jié)論：檜木醇可以顯著抑制J82細胞增殖并通過過度激活自噬促進膀胱癌細胞凋亡。

檜木醇；膀胱癌；細胞增殖；細胞凋亡；細胞自噬

膀胱癌是我國最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來發(fā)病率逐年上升，嚴重威脅著人類的健康［1］。膀胱癌的復(fù)發(fā)率很高，據(jù)統(tǒng)計有16%～25%的復(fù)發(fā)性膀胱癌惡性程度較原發(fā)時有所增加，40%的新發(fā)膀胱癌為分化不好的高級別尿路上皮癌［2］。手術(shù)治療是膀胱癌的主要治療手段，表淺性膀胱癌通過手術(shù)治療可以獲得較為滿意的治療效果，而晚期膀胱癌的治療仍是臨床治療的一大難題。所以找到一種對于膀胱癌，尤其是對中晚期浸潤性膀胱癌滿意的治療方法就顯得尤為緊迫。

檜木醇是一種天然化合物，從柏科植物中提取［3］。已有研究發(fā)現(xiàn)，檜木醇具有抗菌、抗炎、抗氧化及誘導(dǎo)分化等多種生物學作用［4-8］，最近的研究發(fā)現(xiàn)檜木醇可以導(dǎo)致腫瘤細胞DNA損傷，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡［9-11］。但是檜木醇是否具有抗膀胱癌作用尚未見報道，本研究旨在進一步明確檜木醇的抗膀胱癌作用機制，為檜木醇的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人膀胱癌J82細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫；檜木醇購自美國Sigma公司；EGFPLC3質(zhì)粒由日本大阪大學Tamotsu Yoshimori教授惠贈；MEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清及Opti-MEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；CCK-8購自南京凱基生物科技公司；Z-VAD-FMK及3-MA購自美國Santa Cruz公司；Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；本研究所使用抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

人膀胱癌J82細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、CO2體積分數(shù)5%的飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染時，提前24 h將細胞傳代至激光共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿內(nèi)，細胞貼壁后換成Opti-MEM培養(yǎng)基，按LipofectamineTM2000使用說明制備脂質(zhì)體-質(zhì)粒轉(zhuǎn)染復(fù)合物，將該復(fù)合物加入細胞后輕微振蕩，溫育6 h后換成新鮮完全培養(yǎng)基，24 h后觀察轉(zhuǎn)染效果，給予檜木醇刺激后6 h，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照存檔。

1.3 CCK-8細胞增殖實驗

取對數(shù)生長期細胞傳代于96孔板內(nèi)，每孔100 μL細胞懸液(約7 000個細胞/孔)，待細胞貼壁后根據(jù)實驗所需分別加入藥物處理，培養(yǎng)至所需時間后，每孔分別加入10 μL CCK-8溶液，放置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)溫育，根據(jù)培養(yǎng)基顏色變化適時終止反應(yīng)，酶標儀450 nm比色并記錄數(shù)據(jù)。

1.4 Annexin V/PI凋亡檢測

常規(guī)消化細胞，離心后PBS洗滌兩次，加入500 μL結(jié)合緩沖液重懸，加入5 μL的Annexin V和5 μL的PI至細胞懸液內(nèi)，輕輕混勻后避光染色15 min，流式細胞儀檢測，采用Flowjo軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.5 蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測

將細胞裂解后蛋白定量，制樣后取等量蛋白進行SDS-PAGE電泳，300 mA恒流電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，用相應(yīng)一抗于4 ℃下封閉過夜，本研究所使用一抗封閉濃度均為1∶1 000。第2天，TBST洗膜之后用辣根過氧化物酶標記的相應(yīng)二抗室溫封閉1 h。TBST洗膜后，ECL化學發(fā)光，拍照存檔。

1.6 統(tǒng)計學處理

本實驗所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用χ±s 表示，兩樣本均數(shù)間比較采用t檢驗，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間比較采用Dunnett t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 檜木醇抑制膀胱癌J82細胞增殖，誘導(dǎo)J82細胞凋亡

在給予終濃度2.5 μmol/L檜木醇作用J82細胞24 h后，細胞活力明顯下降(P<0.01)，并且該作用呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系(圖1A)。隨著給藥劑量(2.5、5、10和20 μmol/L)的增加，J82細胞增殖抑制率(37.2%、53.5%、87.1%和97.8%)也隨之增加。

對J82細胞進行Annexin V/PI染色之后應(yīng)用流式細胞儀檢測腫瘤細胞凋亡情況。結(jié)果表明檜木醇能夠明顯的誘導(dǎo)J82細胞凋亡，給予2.5 μmol/L檜木醇作用J82細胞24和48 h之后，細胞凋亡率分別上升至4.75%和19.29%(圖1B)。

使用Western blot對凋亡相關(guān)蛋白caspase 3的活性形式cleaved caspase 3的表達量進行檢測，結(jié)果顯示，隨著檜木醇作用時間的延長，J82細胞cleaved caspase 3的表達量明顯上升(圖1C)。我們進一步使用caspase的抑制劑Z-VADFMK抑制caspase活性后進行CCK-8實驗，結(jié)果顯示，Z-VAD-FMK(50 μmol/L，24 h)能夠顯著逆轉(zhuǎn)檜木醇(2.5 μmol/L，24 h)對J82細胞的凋亡誘導(dǎo)作用(P<0.05，圖1D)，說明檜木醇可以抑制膀胱癌J82細胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，且該凋亡效應(yīng)依賴caspase途徑。

2.2 檜木醇能夠誘導(dǎo)膀胱癌J82細胞發(fā)生自噬

EGFP-LC3這一質(zhì)粒能夠表達綠色熒光蛋白EGFP和LC3的融合蛋白，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入J82細胞，待其穩(wěn)定表達后給予檜木醇(2.5 μmol/L，6 h)作用細胞，在激光共聚焦顯微鏡下可以觀察到藥物作用后的細胞內(nèi)綠色熒光點呈明顯的聚集分布，綠色熒光點數(shù)明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖2A、B)。Western blot結(jié)果顯示，使用2.5 μmol/L的檜木醇作用細胞6及12 h后，細胞LC3-Ⅱ蛋白的表達量較對照組明顯上升，P62蛋白表達量明顯下降，且該變化具有時效關(guān)系(圖2C)。說明檜木醇處理后的膀胱癌J82細胞內(nèi)自噬泡的數(shù)量顯著增加，細胞自噬被顯著激活。

2.3 檜木醇過度激活細胞自噬誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡

3-MA是細胞自噬的抑制劑，能夠抑制細胞的自噬活動。我們使用3-MA抑制細胞自噬后再進行CCK-8試驗，結(jié)果顯示，3-MA可以部分逆轉(zhuǎn)檜木醇對腫瘤細胞的作用(P<0.01，圖3A)。使用Western blot進行檢測發(fā)現(xiàn)，3-MA (2 mmol/L，12 h)作用細胞后，LC3-Ⅱ的表達量較對照組明顯下降，檜木醇及3-MA聯(lián)合給藥的LC3-Ⅱ型的表達量較檜木醇單獨作用明顯下降(圖3B)。Cleaved caspase 3的表達量在給予了3-MA后，也出現(xiàn)了明顯的下降(圖3C)。說明檜木醇通過過度激活細胞自噬誘導(dǎo)J82細胞凋亡。

圖1 檜木醇抑制J82細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡Fig. 1 Hinokitiol inhibits proliferation and indues apoptosis of J82 cells

圖2 檜木醇激活J82細胞自噬Fig. 2 Hinokitiol induces autophagy in J82 cells

圖3 檜木醇通過誘導(dǎo)細胞自噬促進細胞凋亡Fig. 3 Hinokitiol induces cell apoptosis via autophagy induction

3 討 論

細胞自噬是生命科學及醫(yī)學領(lǐng)域研究的熱點之一，作為細胞最基本的生理過程，自噬能夠維持細胞的能量代謝及細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。當細胞自噬發(fā)生時，自噬泡能夠?qū)⒋到獾奈镔|(zhì)轉(zhuǎn)運至溶酶體，并與溶酶體融合成自噬溶酶體，溶酶體內(nèi)的酸性水解酶將待降解的物質(zhì)水解成核酸、氨基酸、糖原及脂肪酸等小分子物質(zhì)，進而重新參與物質(zhì)再循環(huán)或直接參與細胞的代謝供能［12］。目前已知細胞自噬與多種疾病密切相關(guān)［13］，如阿爾茨海默病、肥厚性心肌病、慢性阻塞性肺病等。細胞自噬在腫瘤中的作用目前還不是十分清楚，有假說認為生理狀態(tài)下的細胞自噬能夠清除細胞內(nèi)能夠引起DNA損傷的物質(zhì)，如活性氧(reactive oxygen species，ROS)、受損傷的線粒體和錯誤折疊的蛋白質(zhì)等，從而維持細胞基因組DNA的完整性和穩(wěn)定性，進而抑制腫瘤的發(fā)生，當腫瘤形成后，腫瘤細胞能夠通過細胞自噬活動獲得更多的能量，反而促進了腫瘤細胞的存活和生長［14］。

細胞自噬與細胞凋亡之間的關(guān)系及具體機制目前仍不明確。目前的研究認為，當細胞自噬過度激活時，細胞內(nèi)的物質(zhì)由于被過度消耗，從而誘發(fā)了細胞凋亡，當細胞自噬活動受到過度抑制時，由于代謝嚴重障礙和合成底物嚴重不足，細胞也會發(fā)生凋亡［15］。本研究結(jié)果顯示，在給予膀胱癌J82細胞檜木醇處理之后，能夠引起細胞內(nèi)EGFP-LC3熒光點數(shù)的增加和聚集，細胞自噬標志蛋白LC3-Ⅱ的表達量明顯上升，說明細胞內(nèi)自噬泡的數(shù)量顯著增多。為了進一步說明細胞內(nèi)自噬泡的增多是由于細胞自噬激活引起的，我們又檢測了細胞自噬特異性的底物P62蛋白的表達量［16］，結(jié)果顯示，P62的表達量較對照組明顯下降，說明檜木醇能夠顯著激活腫瘤細胞內(nèi)的自噬活動。在本研究中，檜木醇引起J82細胞發(fā)生細胞自噬的時間(6 h)明顯早于腫瘤細胞發(fā)生細胞凋亡的時間(24 h)，為了進一步說明檜木醇引起的細胞凋亡與自噬是否有關(guān)，我們又使用3-MA抑制細胞自噬活動之后進行檢測，結(jié)果表明在抑制了細胞自噬之后檜木醇對腫瘤細胞的殺傷作用能夠被部分逆轉(zhuǎn)，cleaved caspase 3的表達量出現(xiàn)了明顯下降，這些結(jié)果表明檜木醇的細胞凋亡誘導(dǎo)作用與細胞自噬激活有關(guān)，檜木醇能夠過度激活腫瘤細胞的自噬活動，從而誘發(fā)細胞凋亡。

天然植物提取物在腫瘤治療中具有廣闊的應(yīng)用前景，檜木醇作為其中的一員，目前的研究還不夠深入，目前已知其具有抗乳腺癌、肺癌和直腸癌的作用［10-11,17］，且該作用與細胞周期阻滯、DNA損傷和細胞自噬相關(guān)。檜木醇對膀胱癌的作用還未見有報道，本研究從體外水平證實了檜木醇的抗膀胱癌作用，豐富了檜木醇的抗瘤譜，并初步說明其通過過度激活腫瘤細胞自噬誘導(dǎo)細胞凋亡，為該化合物的臨床應(yīng)用和未來開發(fā)提供了實驗依據(jù)。

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Hinokitiol induces bladder cancer J82 cells apoptosis via autophagy induction

GAO Yuren, ZHANG Defu, WANG Liang, LIU Zhiyu (Department of Urology, the Second Hospital of Dalian Medical University, Dalian Liaoning 116023, China)

LIU Zhiyu E-mail: lzydoct@163.com

Background and purpose:Bladder cancer is the most common urological malignancy in our country which seriously threatens human health, and its incidence increased year by year. This study aimed to investigate the effects of hinokitiol on the proliferation, apoptosis and autophagy in human bladder cancer cell lines.Methods:CCK-8 assays were performed to analyze the effects of hinokitiol on the proliferation of J82 cells. Apoptosis rate was determined by flow cytometry. Cleaved caspase 3, LC3 and P62 protein expression was determined using Western blot. EGFP-LC3 microscopy assay was performed to assess autophagy.Results:Hinokitiol significantly inhibited the proliferation of J82 cells and induced cell apoptosis via caspase pathway. The apoptosis effect of hinokitiol could be partially antagonized by Z-VAD-FMK. Hinokitiol induced autophagy of J82 cells, increased LC3 expression and down-regulated P62 expression. 3-MA is able to rescue Tet-induced cell death.Conclusion:Hinokitiol can inhibit the proliferation of J82 cells and induce cell apoptosis via autophagy activation.

Hinokitiol; Bladder cancer; Cell apoptosis; Cell proliferation; Cell autophagy

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.05.008

R737.14

A

1007-3639(2015)05-0365-06

2014-12-03

2015-01-29）

劉志宇 E-mail:lzydoct@163.com