曾高峰，宗少暉，傅松文，農(nóng)夢妮，李柯柯，嚴(yán)芳娜

1 廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院;2 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院脊柱骨病外科;3廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，南寧 530021

已有的研究表明，阿爾茨海默病發(fā)病過程中的神經(jīng)退行性改變與β 淀粉樣蛋白的過量分泌密切相關(guān)［1］。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，大鼠腦室內(nèi)注射入Aβ 后，表現(xiàn)出認(rèn)知功能、記憶功能降低等AD 樣癥狀及神經(jīng)元細(xì)胞凋亡等［2］。因而，抑制Aβ 誘導(dǎo)的神經(jīng)元變性可能對AD 的防治具有重要作用。此外，大量的研究顯示Aβ 引起的神經(jīng)毒性作用與PI3K/Akt/GSK-3β 信號(hào)通路密切相關(guān)［3，4］。故逆轉(zhuǎn)Aβ 通過PI3K/Akt/GSK-3β 信號(hào)通路導(dǎo)致的細(xì)胞毒性，可能成為防治AD 的途徑之一。研究顯示，6-姜酚可減輕Aβ 誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡，因而可能具有神經(jīng)保護(hù)作用［5］。然而，6-姜酚對AD 的防治作用尚未清楚，本研究旨在觀察6-姜酚在Aβ1-42導(dǎo)致的PC12 細(xì)胞凋亡中的作用及其分子信號(hào)通路基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

β 淀粉樣蛋白(1-42)(武漢明皓生物科技股份有限公司)，6-姜酚(上海撫生實(shí)業(yè)有限公司)，F(xiàn)12K培養(yǎng)基(武漢博士德)，神經(jīng)生長因子(NGF，美國Millipore 公司)，馬血清(美國Gibco 公司)，胎牛血清(美國Gibco 公司)，噻唑蘭(MTT，Amresco 公司)，Akt、p-Akt(Ser473)、GSK-3β 及 p-GSK-3β(Ser9)抗體均購自于美國CST 公司，未分化PC12細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 PC12 細(xì)胞的培養(yǎng)

PC12 細(xì)胞接種于含10% 馬血清、5% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的F12K培養(yǎng)基中，并置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d 換液一次。

1.3 MTT 法檢測PC12 細(xì)胞的存活率

PC12 細(xì)胞接種于96 孔板，經(jīng)NGF 誘導(dǎo)分化5 d 后，分別加入5、10 及20 μM Aβ1-42作用24、48 及72 h，MTT 實(shí)驗(yàn)分別檢測不同濃度Aβ1-42對PC12 細(xì)胞作用24、48 及72 h 的細(xì)胞存活率;PC12 細(xì)胞中分別加入40、80、120、200 及300 μM 的6-姜酚作用4 h 后，加入10 μM Aβ1-42繼續(xù)培養(yǎng)48 h，MTT 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞存活率，以觀察6-姜酚對Aβ1-42所致的PC12 細(xì)胞凋亡的影響。具體步驟為，藥物作用結(jié)束后，每孔加入10 μL 5 mg/mL MTT 并置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，然后棄去反應(yīng)后的上清液，加入150 μL DMSO 后置于振蕩器上振蕩10 min，紫色結(jié)晶完全溶解后，酶標(biāo)儀570 nm 波長測吸光度。

1.4 Western blot 分析

藥物作用結(jié)束后，離心收集PC12 細(xì)胞，以PBS漂洗2 遍后，加入RIPA 裂解液并置于冰上以將細(xì)胞充分裂解，離心收集上清液，采用BCA 法定量蛋白濃度。蛋白經(jīng)變性后，以8% SDS-PAGE 進(jìn)行電泳，蛋白經(jīng)電泳分離后，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上。在室溫下，以5% BSA 封閉1 h 后，分別加入GSK-3β、p-GSK-3β(Ser9)、Akt 及p-Akt 抗體并置于4 ℃，緩慢平搖孵育過夜。以TBST 進(jìn)行漂洗4 遍后，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗并于室溫下，緩慢平搖孵育1.5 h，再以TBST 進(jìn)行漂洗4 遍，在暗房中以ECL 發(fā)光顯色劑對蛋白進(jìn)行顯色，并采用Image J 軟件對蛋白條帶進(jìn)行定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Aβ1-42對PC12 細(xì)胞存活率的影響

由圖1 可見，分別以5、10 及20 μM 濃度的Aβ1-42 對分化的PC12 細(xì)胞進(jìn)行處理24、48 h 及72 h，各時(shí)間組的細(xì)胞存活率，隨著Aβ1-42濃度的增加而下降，且10、20 μM 組細(xì)胞存活率顯著下降(P＜0.05);Aβ1-42處理組細(xì)胞存活率隨著作用時(shí)間延長而下降，與作用24 h 相比，48、72 h 各濃度組細(xì)胞存活率均顯著降低(P＜0.05)。

圖1 Aβ1-42對PC12 細(xì)胞存活率的影響Fig.1 The effect of Aβ1-42on PC12 cell viability

2.2 6-姜酚對Aβ1-42致PC12 細(xì)胞凋亡的抑制作用

如表1 所示，與對照組相比，10 μM Aβ1-42對PC12 細(xì)胞進(jìn)行作用48 h 后的細(xì)胞存活率顯著下降，而以80、120 及200 μM 的6-姜酚對PC12 細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理4 h 后再加入Aβ1-42(10 μM)繼續(xù)培養(yǎng)48 h 的細(xì)胞存活率則較Aβ1-42處理組顯著上升(如表2 所示)。表明6-姜酚在80、120、200 μM 時(shí)均能顯著減少Aβ1-42引起的細(xì)胞凋亡，并且120 μM 的6-姜酚作用最明顯;但當(dāng)濃度達(dá)300 μM 時(shí)，則可加重細(xì)胞凋亡。

表1 6-姜酚對Aβ1-42致PC12 細(xì)胞凋亡的抑制作用(±S)Table 1 The inhibitory effect of 6-gingerol on Aβ1-42-induced apoptosis in PC12 cells(±S)

表1 6-姜酚對Aβ1-42致PC12 細(xì)胞凋亡的抑制作用(±S)Table 1 The inhibitory effect of 6-gingerol on Aβ1-42-induced apoptosis in PC12 cells(±S)

注:與對照組比較，* P＜0.05，與Aβ1-42處理組比較，▲P＜0.05。Note:Compared with the control group，* P＜0.05;Compared with the Aβ1-42treatment group，▲P＜0.05.

2.3 6-姜酚對Aβ1-42誘導(dǎo)的GSK-3β、Akt 磷酸化水平的影響

為了觀察PI3K/Akt/GSK-3β 信號(hào)通路在6-姜酚保護(hù)PC12 細(xì)胞對抗Aβ1-42引起的細(xì)胞毒性的作用，以80、120 及200 μM 6-姜酚對PC12 細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理4 h 后，再加入Aβ1-42(10 μM)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，采用蛋白免疫印跡法檢測PC12 細(xì)胞中GSK-3β、p-GSK-3β、Akt 及p-Akt 的表達(dá)水平。結(jié)果顯示(圖2、圖3):10 μM Aβ1-42處理組中PC12 細(xì)胞的GSK-3β磷酸化水平較對照組顯著降低，而80 及120 μM 的6-姜酚預(yù)處理組中GSK-3β 的磷酸化水平則顯著高于Aβ1-42處理組的;以10 μM Aβ1-42對PC12 細(xì)胞進(jìn)行作用48 h 后的Akt 磷酸化水平較對照組顯著降低，而以80 及120 μM 的6-姜酚對PC12 細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理4 h 后再加入Aβ1-42(10 μM)繼續(xù)培養(yǎng)48 h 的PC12 細(xì)胞的Akt 磷酸化水平則顯著高于Aβ1-42處理組的。

圖2 6-姜酚對Aβ1-42誘導(dǎo)的GSK-3β 磷酸化水平的影響Fig.2 Effect of 6-gingerol on Aβ1-42-induced activation of GSK-3β

圖3 6-姜酚對Aβ1-42誘導(dǎo)的Akt 磷酸化水平的影響Fig.3 Effect of 6-gingerol on Aβ1-42-induced activation of Akt

3 討論與結(jié)論

體內(nèi)研究表明，Aβ1-42可致大鼠神經(jīng)發(fā)生退行性改變［6］。本研究結(jié)果顯示，PC12 細(xì)胞的存活率隨著Aβ1-42濃度的增加及作用時(shí)間的延長而下降，且10及20 μM Aβ1-42組在作用24、48 及72 h 后的細(xì)胞存活率均較對照組顯著下降(P＜0.05);與作用24 h相比，48 h 及72 h 各濃度組細(xì)胞存活率均顯著降低。因而Aβ1-42可誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞發(fā)生凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞存活率下降，這與以往的研究結(jié)果一致［7，8］。而6-姜酚在80、120、200 μM 時(shí)均能顯著減少Aβ1-42引起的細(xì)胞凋亡，并且在120 μM 時(shí)抑制效果最明顯;但當(dāng)濃度達(dá)300 μM 時(shí)，則可加重細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明，6-姜酚在80～200 μM 的濃度范圍內(nèi)，通過對Aβ1-42所致細(xì)胞凋亡的抑制作用，表明6-姜酚對Aβ1-42所致的細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，但高濃度的6-姜酚(300 μM)則具有毒性作用［9，10］。

AD 的發(fā)生與GSK-3β 密切相關(guān)。研究表明，tau蛋白的異常磷酸化通過神經(jīng)毒性作用介導(dǎo)神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生，如AD［11，12］，而GSK-3β 的活化可引起tau 蛋白的磷酸化水平異常增高［13］。此外，GSK-3β 的活化可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡及酶的失活［14］，而GSK-3β 的磷酸化水平增高可抑制GSK-3β 的活性［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，PC12 細(xì)胞經(jīng)Aβ1-42作用48 h 后，GSK-3β 的磷酸化水平較正常組顯著降低，表明Aβ1-42可激活GSK-3β 的活性。以80 及120 μM 的6-姜酚對PC12 細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理4 h 后再加入Aβ1-42(10 μM)繼續(xù)培養(yǎng)48 h 的PC12 細(xì)胞的GSK-3β 磷酸化水平則顯著高于Aβ1-42處理組的，這表明6-姜酚可抑制由Aβ1-42激活的GSK-3β 活性。因而，6-姜酚對Aβ1-42誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用可能與其抑制GSK-3β 的活性有關(guān)。

通過PI3K 通道，Akt 在Ser473 位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，介導(dǎo)了Akt 的激活［16］，從而具有神經(jīng)保護(hù)作用［17］。研究表明，抑制PI3K/Akt 通道可顯著增加GSK-3β 的活性，導(dǎo)致tau 蛋白過度磷酸化［18］，從而與AD 的發(fā)生密切相關(guān)。而Akt 的激活，可以抑制GSK-3β 的活性［19］。本研究結(jié)果顯示，Aβ1-42處理組中PC12 細(xì)胞的Akt 磷酸化水平較對照組顯著降低，而80 及120 μM 6-姜酚預(yù)處理組中Akt 的磷酸化水平則顯著高于Aβ1-42處理組的，表明Aβ1-42可抑制PC12 細(xì)胞的Akt 活性，而6-姜酚可顯著抑制Aβ1-42導(dǎo)致的Akt 活性的下降。因而6-姜酚對Aβ1-42誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用可能與其激活A(yù)kt 的活性有關(guān)。

總之，本研究表明，6-姜酚可能通過PI3K/Akt/GSK-3β 信號(hào)通路保護(hù)PC12 細(xì)胞對抗Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

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