王 娟，任莉萍，屈長(zhǎng)青，2，孫予文，姬云濤*，魯安娜

1 阜陽(yáng)師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院;2 抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心，阜陽(yáng) 236037

香椿Toona sinensis(A.Juss.)Roem.又名紅椿、椿樹(shù)，為楝科香椿屬多年生落葉喬木［1］，是我國(guó)特有樹(shù)種，由于其具有材、菜、藥等作用，因此在我國(guó)大面積栽培。據(jù)《本草綱目》記載，香椿的芽、葉、根、皮和果實(shí)均可入藥。許多研究表明，香椿含有豐富的黃酮、多酚、生物堿、氨基酸等多種生物活性成分［2-4］，具有顯著的降血糖、抗氧化、消炎、抑菌、抗癌等藥用作用［5-7］。

香椿子又可稱(chēng)為椿花、香椿鈴，是香椿的果實(shí)。研究表明，香椿子含有多酚、揮發(fā)油、生物堿等多種活性成分，具有較強(qiáng)的抗氧化［8］、降血糖［9］等作用。近年來(lái)，對(duì)香椿的理化性質(zhì)、藥理作用的研究多集中在香椿葉［10，11］，而關(guān)于其副產(chǎn)物如種子、老葉等的研究較少，特別是以與人類(lèi)有相同的壽命基因［12］和超過(guò)60%疾病基因有直系同源物的果蠅為模式生物的報(bào)道更是少之又少。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在果蠅培養(yǎng)基中添加香椿子粉末制作成含不同濃度香椿子的培養(yǎng)基，研究其對(duì)黑腹果蠅的壽命及其抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響作用，以期為香椿子的合理開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

香椿子，購(gòu)于安徽亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)阜陽(yáng)師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院姜雙林教授鑒定為楝科植物香椿的干燥果實(shí);野生型黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)，由阜陽(yáng)師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器與試劑

儀器:GHP-300 型智能光照培養(yǎng)箱;LDZX-50FBS 型高壓蒸汽滅菌器;TGL-20M 高速冷凍離心機(jī);UV762 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海佑科儀器有限公司);普力菲爾超純水機(jī)(上海高詩(shī)特儀器公司)。

試劑:蔗糖，瓊脂，酵母粉，考馬斯亮藍(lán)G-250，丙酸，乙醚，SOD 試劑盒、CAT 試劑盒以及MDA 試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 果蠅培養(yǎng)基的配制

該研究采用玉米粉基礎(chǔ)培養(yǎng)基和香椿子培養(yǎng)基。基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方為:玉米粉83 g，蔗糖62 g，酵母粉7 g，瓊脂6.2 g，蒸餾水760 mL，丙酸5 mL;香椿子培養(yǎng)基在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入香椿子粉末，使其終濃度分別為1、5、10 g/L。

1.4 果蠅生存實(shí)驗(yàn)

乙醚麻醉收集8 h 內(nèi)羽化未交配的果蠅成蟲(chóng)，鑒別雌雄后隨機(jī)分組培養(yǎng)，每組果蠅雌雄各90 只，對(duì)照組果蠅飼喂基礎(chǔ)培養(yǎng)基，處理組果蠅飼喂含香椿子濃度分別為1、5、10 g/L 的培養(yǎng)基，每組設(shè)三個(gè)重復(fù)，置于25±1 ℃、相對(duì)濕度為60%～75%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每5 d 更換一次培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，每天定時(shí)觀(guān)察記錄各組果蠅死亡數(shù)目，直至全部死亡。分別統(tǒng)計(jì)各組雌、雄果蠅的平均壽命(每組雌、雄果蠅存活天數(shù)的算術(shù)平均數(shù)為平均壽命)、最高壽命(每組最后10 只死亡果蠅存活天數(shù)的算術(shù)平均數(shù)為最高壽命)和半數(shù)死亡時(shí)間(每組半數(shù)果蠅死亡天數(shù)為半數(shù)死亡時(shí)間)［13］。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中因轉(zhuǎn)管培養(yǎng)時(shí)飛走或過(guò)度麻醉、培養(yǎng)基粘住等偶然因素死亡的果蠅數(shù)目不計(jì)。

1.5 果蠅SOD、CAT 活性以及MDA 和蛋白含量的測(cè)定

參照展俊娟等人［14］的方法并稍作修改:挑取剛羽化的果蠅成蟲(chóng)，雌雄分別在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d，饑餓4 h 后，隨機(jī)分為對(duì)照組和三個(gè)處理組，每組雌雄各120 只。飼喂培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件同壽命實(shí)驗(yàn)。在飼喂30 d 后，每組以20 只果蠅為一個(gè)樣本，隨機(jī)分為3 個(gè)樣本，稱(chēng)其重量，冰浴制成組織勻漿，離心，取上清液。按照試劑盒說(shuō)明分別檢測(cè)各組果蠅組織的總SOD(羥胺比色法)、CAT(紫外分光光度法)活性和MDA(硫代巴比妥酸法)、蛋白(考馬斯亮藍(lán)G-250 法)含量，結(jié)果取其平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)所獲數(shù)據(jù)采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，采用LSD 法檢驗(yàn)差異顯著性，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 香椿子對(duì)果蠅壽命的影響

由表1 可知，與對(duì)照組相比，香椿子濃度為1、5、10 g/L 的果蠅的平均壽命、最高壽命和半數(shù)死亡期均有延長(zhǎng)，且隨著香椿子濃度的升高而延長(zhǎng)，即存在濃度依賴(lài)關(guān)系;在濃度為10 g/L 時(shí)，雌雄果蠅的平均壽命、最高壽命和半數(shù)死亡期均存在顯著差異(P＜0.05)或極顯著差異(P＜0.01);通過(guò)雌雄組的對(duì)比還可以發(fā)現(xiàn)，雌果蠅的平均壽命、最高壽命以及半數(shù)死亡期均比雄果蠅增長(zhǎng)快，說(shuō)明香椿子對(duì)雌果蠅壽命影響高于雄果蠅。

2.2 香椿子對(duì)果蠅SOD、CAT 酶活力的影響

如表2 所示，雌雄果蠅組織總SOD、CAT 酶活力隨著香椿子濃度的升高而不斷增強(qiáng)。通過(guò)與對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)，香椿子濃度為1 g/L 時(shí)，雌果蠅組織總SOD 酶活力差異顯著(P＜0.05)，雄果蠅差異不顯著(P＞0.05)，當(dāng)濃度為5 g/L 和10 g/L 時(shí)雌雄果蠅的SOD 活性均表現(xiàn)為顯著差異(P＜0.01 或P＜0.05)。研究還發(fā)現(xiàn)，隨著香椿子濃度的升高，雌蠅體內(nèi)SOD 活性比雄蠅增長(zhǎng)快。

當(dāng)香椿子濃度為1 g/L 時(shí)，雌果蠅體內(nèi)CAT 酶活力與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)，雄果蠅差異不顯著(P＞0.05);當(dāng)濃度為5 g/L 和10 g/L 時(shí)，雌雄果蠅體內(nèi)CAT 酶活力的增加均具有極顯著差異(P＜0.01)。

表1 不同濃度香椿子對(duì)果蠅壽命的影響(n=30，±s)Table 1 Effects of different concentrations of T.sinensis seed on life-span of D.melanogaster(n=30，±s)

表1 不同濃度香椿子對(duì)果蠅壽命的影響(n=30，±s)Table 1 Effects of different concentrations of T.sinensis seed on life-span of D.melanogaster(n=30，±s)

注:與空白對(duì)照組相比* P＜0.05;＊＊ P＜0.01，下同。Note:* P＜0.05;＊＊ P＜0.01 vs normal control group，same as below.

表2 不同濃度的香椿子對(duì)果蠅SOD、CAT 活性的影響(n=20，±s)Table 2 Effect of different concentrations of T.sinensis seed on the activity of SOD and CAT of D.melanogaster(n=20，±s)

表2 不同濃度的香椿子對(duì)果蠅SOD、CAT 活性的影響(n=20，±s)Table 2 Effect of different concentrations of T.sinensis seed on the activity of SOD and CAT of D.melanogaster(n=20，±s)

2.3 香椿子對(duì)果蠅MDA 含量的影響

香椿子各濃度組雌雄果蠅體內(nèi)MDA 含量均呈下降趨勢(shì)。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)香椿子濃度為1 g/L時(shí)，雌雄果蠅MDA 含量與對(duì)照組相比差異不顯著(P＞0.05)，而當(dāng)濃度為5 g/L 與10 g/L 時(shí)，可顯著降低雌雄果蠅體內(nèi)MDA 的含量(P＜0.05 或P＜0.01)，且對(duì)雌蠅的影響較為明顯，見(jiàn)圖1。

2.4 香椿子對(duì)果蠅蛋白含量的影響

圖1 不同濃度香椿子對(duì)果蠅MDA 含量的影響Fig.1 Effect of different concentrations of T.sinensis seed on MDA content in D.melanogaster

圖2 不同濃度香椿子對(duì)果蠅蛋白含量的影響Fig.2 Effect of different concentrations of T.sinensis seed on protein concent in D.melanogaster

蛋白質(zhì)是動(dòng)物細(xì)胞、組織的重要成分，其含量的變化直接影響動(dòng)物的各種生理機(jī)能和生長(zhǎng)發(fā)育情況。如圖2 所示，不同香椿子濃度組雌雄果蠅組織的總蛋白含量較對(duì)照組均有增加，且雌蠅增加量高于雄蠅。濃度為5 g/L 與10 g/L 的香椿子組的雌雄果蠅組織總蛋白含量與對(duì)照相比，差異均顯著(P＜0.05 或P＜0.01)，而當(dāng)濃度較低為1 g/L 時(shí)，雌雄果蠅蛋白含量與對(duì)照相比差異均不顯著(P＞0.05)。

3 討論

本文研究了香椿子對(duì)黑腹果蠅的壽命、抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響作用。結(jié)果表明，雌雄果蠅的平均壽命、最高壽命以及半數(shù)死亡期在一定濃度范圍內(nèi)與香椿子存在劑量依賴(lài)關(guān)系，當(dāng)濃度為10 g/L 時(shí)，雌雄果蠅的平均壽命、最高壽命和半數(shù)死亡期均達(dá)到顯著差異(P＜0.05)或極顯著差異(P＜0.01)，且在同劑量條件下雌蠅的延長(zhǎng)率高于雄蠅;研究還發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)基中香椿子濃度增加，果蠅組織總SOD、CAT 酶活力不斷增強(qiáng)，MDA 含量下降，蛋白含量增加，且對(duì)雌蠅的影響優(yōu)于雄蠅，說(shuō)明香椿子對(duì)果蠅的影響存在性別差異。

果蠅由于具有與人類(lèi)相似的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老階段，因此常用于延緩衰老實(shí)驗(yàn)［15］中，其生存實(shí)驗(yàn)也已普遍作為檢測(cè)延緩衰老作用的實(shí)驗(yàn)手段之一［16］。本文關(guān)于香椿子對(duì)果蠅壽命的影響結(jié)果與王菊鳳等人［17］關(guān)于蛹蟲(chóng)草多糖對(duì)果蠅壽命的研究以及楊冬梅等人［18］關(guān)于爬沙蟲(chóng)提取液對(duì)果蠅壽命的研究結(jié)果相一致，而與蘭瑛等人［19］關(guān)于尖頂羊肚菌胞外多糖提取物對(duì)果蠅壽命的研究相反，究其原因可能與雌雄果蠅的陰陽(yáng)體質(zhì)、生理反應(yīng)以及生化代謝方面存在差異有關(guān)。生物體的衰老是一個(gè)多因素作用的復(fù)雜過(guò)程，而自由基增多促進(jìn)衰老學(xué)說(shuō)更是得到普遍認(rèn)可。超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)具有專(zhuān)一清除自由基能力的重要抗氧化酶之一，可以解除自由基對(duì)生物體及其某些組成成分的破壞，阻止脂質(zhì)過(guò)氧化連鎖反應(yīng)，減少體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物的生成。丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，其含量高低可間接反映脂質(zhì)過(guò)氧化程度，其與蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子交聯(lián)聚合，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及其功能，引發(fā)細(xì)胞進(jìn)行性退行性病變，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體的衰老［20］。本研究顯示，香椿子可以提高果蠅組織的抗氧化能力，這可能是由于香椿子的有效成分對(duì)雌雄果蠅體內(nèi)抗氧化酶“靶”作用種類(lèi)和數(shù)量的不同，亦或者是生物體存在選擇性，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究和論證。

綜上所述，合適劑量的香椿子能明顯延長(zhǎng)雌雄果蠅的平均壽命、最高壽命和半數(shù)死亡時(shí)間，提高雌雄果蠅體內(nèi)抗氧化能力，增強(qiáng)蛋白質(zhì)合成能力，因此香椿子具有很好的抗衰老作用。但是，香椿子對(duì)果蠅的抗衰作用存在性別差異，因此在以后的開(kāi)發(fā)研究中還需考慮性別差異以及劑量濃度。

1 Yu CB(余超波).Forest vegetables-Toona sinensis.J Plant(植物雜志)，1998，1:7.

2 Luo XD(羅曉東)，Wu SH(吳少華)，Ma YB(馬云保)，et al.Studies on chemical constituents of Toona sinensis.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2001，32:390-391.

3 Wang KJ，Yang R，Zhang YJ.Phenolic antioxidants from Chinese toon(fresh young leaves and shoots of Toona sinensis).Food Chem，2007，101:365-371.

4 Zhu H(朱宏)，Chen M(陳敏)，Sun T(孫恬)，et al.Effect of different processing approaches on antioxidant activity of Toona sinensis polyphones.J Chin Agric Univ(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào))，2010，15:111-114.

5 Yang CJ，Huang YJ，Wang CY，et al.Antiproliferative effect of Toona sinensis leaf extract on non-small-cell lung cancer.Transl Res，2010，155:305-314.

6 Chang HL，Hsu HK，Su JH，et al.The fractionated Toona sinensis leaf extract induces apoptosis of human ovarian cancer cells and inhibits tumor growth in a murine xenograft model.Gynecol Oncol，2006，102:309-314.

7 Chen YK(陳元坤)，Ou HP(歐紅萍)，F(xiàn)ang CL(房春林)，et al.Antibacterial test of cortex toonae and cortex ailanthi in vitro.Chin Anim Health(中國(guó)動(dòng)物保健)，2011，5:24-26.

8 Huang XY(黃小燕)，Li SL(李松林)，Dang CZ(黨翠芝)，et al.Study on antioxidative activity and ingredient of extract from Toona sinensis fruit.Seed(種子)，2011，30(7):79-82.

9 Xing SS(邢莎莎)，Chen C(陳超).Studies on hypoglycemic effects of total polyphenols from the seed of Toona sinensis.Pharmacol Clin Chin Mater Clin Med(中藥藥理與臨床)，2011，27(3):42-44.

10 Chen CJ(陳叢瑾)，Qin GH(覃桂華)，Qin YB(覃宇奔).Study on the hotwater refluxing extraction conditions of polysaccharide from Toona sinensis(A.Juss)Roem.leaves.Chin J Spectro Lab(光譜實(shí)驗(yàn)室)，2010，27:22-26.

11 Lin CX，Lee E，Jin MH，et al.Deoxypodophyllotoxin(DPT)inhibits eosinophil recruitment into the airway and Th2 cytokine expression in an OVA-induced lung inflammation.Planta Med，2006，72:786-791.

12 Cheng P，Ho YW.Black tea theaflavins extend the lifespan of fruit flies.Exp Gerontol，2009，44:773-783.

13 Yang DM(楊冬梅)，Li JN(李俊年)，Zhang L(張麗)，et al.The effect of freezing-dried hornet pupae on the longevity and reproductivity of the Drosophila melanogaster.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā))，2005，17:450-452.

14 Zhan JJ(展俊娟)，Zhang Z(張錚)，Zhang XG(張序貴)，et al.Effect of polysaccharide of Grifola frondosa on fertility and antioxidant activities of Drosophila melanogaster.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā))，2012，24:520-524.

15 Liu ZD(劉祖洞).Genetics Experiment，2stEd.Beijing:Higher Education Press，1991.63-64.

16 Xu SH(徐思紅)，Zhang XW(張欣文)，Li SG(厲曙光).Indexes and effect factors of drosophila living test for health foods.Chin J Food Hygiene(中國(guó)食品衛(wèi)生雜志)，1999，11:6-8.

17 Wang JF(王菊鳳)，Li HM(李鵠鳴).Influence of Cordyceps militaris polysaccharide on expected Life of Drosophila melanogaster population.Chin Wild Plant Res(中國(guó)野生植物資源)，2008，27(3):38-48.

18 Yang DM(楊冬梅)，Tao SL(陶雙倫)，He L(何嵐)，et al.Effects of Protohermes grandis extract on reproductive capaci-ty and life-span of Drosophila melangogaste.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā))，2012，24:366-369.

19 Lan Y(蘭瑛)，Pan ZF(潘志福)，Zhang S(張松)，et al.The influence of exopolysaccharide extract of Morchella conica on Fruit Fly’s life-span.Edi Fun China(中國(guó)食用菌)，2010，29(4):43-45.

20 Cui X(崔旭)，Guo Y(郭英)，Sui ZR(隋志仁)，et al.Effect of Rhodiola compound on life span and free radical metabolism of the housefly.J Norman Bethune Univ，Med Sci(白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，醫(yī)學(xué)版)，1995，21:347-349.