汪建樣，殷嫦嫦，王子瑤，耿書(shū)國(guó)，胡文龍，殷 明

1 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院;2 南昌大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)部，南昌 330006;3 九江學(xué)院，九江 332000

關(guān)節(jié)軟骨屬于透明軟骨，營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和代謝產(chǎn)物的排泄需要通過(guò)關(guān)節(jié)液，一旦發(fā)生損傷難以自我修復(fù)和再生［1］。軟骨損傷很容易引起關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)和功能的破壞，導(dǎo)致劇烈的疼痛和功能障礙，甚至致殘［2］。傳統(tǒng)的治療方案只能緩解疼痛、維持關(guān)節(jié)的功能，但不能恢復(fù)軟骨的結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)特性。目前，軟骨組織工程技術(shù)被認(rèn)為是治療軟骨損傷的最有前景的方法之一，可能能夠在更大程度上改善患者生活質(zhì)量、延緩關(guān)節(jié)退變及人工關(guān)節(jié)置換［3］。生長(zhǎng)分化因子(GDF)5 是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)超家族成員之一，能夠誘導(dǎo)BMSCs 成軟骨分化［4］。淫羊藿素(Icaritin，ICT)是淫羊藿主要活性成分淫羊藿苷的的衍生物。大量研究表明，ICT 具有類(lèi)雌激素作用、抗氧化、防治骨質(zhì)疏松、促進(jìn)成骨分化、防治前列腺癌、肝癌、腎癌、乳腺癌等作用［5］。但淫羊藿素體外對(duì)于BMSCs 向軟骨細(xì)胞分化作用的研究尚少。本次實(shí)驗(yàn)我們利用GDF-5 聯(lián)合ICT 體外誘導(dǎo)大鼠BMSCs 向軟骨細(xì)胞分化，探討淫羊藿素體外是否能夠促進(jìn)BMSCs 向軟骨細(xì)胞分化，為軟骨損傷治療提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3 周齡SPF 級(jí)SD 大鼠(雌雄不限)，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格號(hào):43004700014337。試驗(yàn)單位使用許可證編號(hào):SYXK(贛)2012-0002。

1.2 主要試劑

DMEM/F12 培養(yǎng)基(Hyclone 公司)，胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶(含EDTA)(GIBCO 公司)，Recombinant murine GDF-5(PEPROTECH 公司)，淫羊藿素(上海原葉，HPLC≥98%)，Alcian Blue 8GX(Solarbio 公司)，GREENspin 細(xì)胞RNA 快速提取試劑盒(北京莊盟)，HiFiScript 快速去基因組cDNA 第一鏈合成試劑盒，2×Taq Master Mix、DNA Ladder 2000(SinoBio)，引物合成(上海生工生物)，總蛋白提取試劑盒(普利萊基因技術(shù)有限公司)，Prestained Protein Ladder(Thermo Scientific 公司)，GAPDH 多克隆抗體、COL1A2 多克隆抗體(Proteintech 公司)，Anti-Collagen II antibody(abcam 公司)，Goat Anti-Rabbit IgG，HRP(康為世紀(jì))，高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(康為世紀(jì))。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 BMSCs 分離、培養(yǎng)

本研究團(tuán)隊(duì)已建立了rBMSCs 的分離、培養(yǎng)及純度鑒定的研究實(shí)驗(yàn)條件［6］。取3 周齡SPF 級(jí)SD大鼠，頸椎脫臼法處死，75%酒精浸泡30 min，消毒后無(wú)菌分離出股骨和脛骨，采用全骨髓貼壁法分離rBMSCs。用含10% FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞接種于塑料中，72 h 后換液，以后每2 d 換液一次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%時(shí)按1∶2 傳代。反復(fù)貼壁純化，取P3 代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.2 BMSCs 向軟骨細(xì)胞分化

取P3 代細(xì)胞，常規(guī)消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，接種于24 孔板中，同時(shí)將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106/mL 接種于6 孔板中，并按以下分組進(jìn)行誘導(dǎo):(1)對(duì)照組;(2)Icaritin 組;(3)GDF-5 組;(4)Icaritin+GDF-5 聯(lián)合組。上述各組細(xì)胞均采用10%FBS+DMEM/F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中Icaritin 的終濃度為5 μmol/L，GDF-5 的終濃度為100 ng/mL，每2 d 換液一次，誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

2.3 蛋白聚糖的Alcian Blue 染色

取誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d 后的24 孔板進(jìn)行Alcian Blue染色，PBS 漂洗3 次×5min，4% 多聚甲醛固定30 min，PBS 漂洗1 次，0.1 mol/L 鹽酸溶液漂洗5min使pH 降至1.0，1% Alcian Blue 染色過(guò)夜，最后用0.1 mol/L 鹽酸溶液洗脫非特異性染色。倒置相差顯微鏡下觀察染色情況。

2.4 RT-PCR 檢測(cè)成軟骨分化相關(guān)基因表達(dá)

取誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d 后的6 孔板，按GREENspin 細(xì)胞RNA 快速提取試劑盒說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA。按HiFiScript 快速去基因組cDNA 第一鏈合成試劑盒說(shuō)明將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按2×Taq Master Mix說(shuō)明進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系:cDNA 1 μL、上游和下游引物各1 μL、2×Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，總反應(yīng)體系25 μL。擴(kuò)增后產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳25 min 左右。SIM 凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度值。內(nèi)參為GAPDH，目的基因?yàn)?Aggrecan、Col2a1、Col1a1、Sox9，引物序列和產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR 引物序列Table 1 Sequences of primers

2.5 Western Blot 檢測(cè)軟骨標(biāo)記蛋白表達(dá)

取誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d 后的6 孔板，按總蛋白提取試劑盒說(shuō)明提取細(xì)胞蛋白。BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。加入4×蛋白質(zhì)上樣緩沖液95 ℃水浴5 min 變性。每組蛋白上樣量為30 μg，在SDS-聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠中電泳;然后用濕轉(zhuǎn)法將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上;將PVDF 膜置于含5%脫脂奶粉的TBST 中室溫封閉2 h;分別加入 GAPDH(1∶3000)、Col2(1∶5000)、Col1(1∶8000)一抗工作液室溫孵育2 h，1×TBST 漂洗3 次，每次5 min;用含標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶的二抗(1∶6000)室溫孵育2 h;漂洗后于暗室用ECL 試劑盒進(jìn)行曝光、顯影、定影。晾干后，以GAPDH 為內(nèi)參，用ImageJ 進(jìn)行灰度分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均以±s 的形式表示。計(jì)數(shù)資料兩樣本間率的比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平α=0.05，組間比較采用單因素方差分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 rBMSCs 的形態(tài)學(xué)觀察

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)接種于培養(yǎng)瓶中，第3 d 部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形、多角形(圖1A)，第10 d 細(xì)胞呈集落生長(zhǎng)，漩渦狀，近似魚(yú)群樣分布但有少量雜細(xì)胞，約90%融合(圖1B)。傳至P3 代，細(xì)胞形態(tài)基本均一，長(zhǎng)梭形或扁平狀，呈典型密集旋渦狀、魚(yú)群樣排列貼壁生長(zhǎng)(圖1C)。

圖1 BMSCs 原代培養(yǎng)3d(A)、BMSCs 原代培養(yǎng)10d(B)及BMSCs 第三代培養(yǎng)3d(C)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(×100)Fig.1 Cellular morphology observation of primary BMSCs cultured for 3 days(A)，primary BMSCs cultured for 10 days and BMSCs at passage 3 cultured for 3 days(C)(×100)

3.2 rBMSCs 成軟骨分化的形態(tài)改變及蛋白聚糖的Alcian Blue 染色結(jié)果

圖2 對(duì)照組(A)、淫羊藿素(B)、GDF-5 組(C)及Icaritin+GDF-5 聯(lián)合組(D)連續(xù)誘導(dǎo)14 d 后細(xì)胞形態(tài)變化及分泌蛋白多糖量的變化(×100)Fig.2 The morphological changes and content of cells secretory proteoglycan changes in control group(A)，Icaritin group(B)，GDF-5 group(C)and Icaritin+GDF-5 group(D)induced for 14 days(×100)

各組細(xì)胞隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)密度逐漸增加，淫羊藿素(Icaritin)組、GDF-5 組、Icaritin+GDF-5 聯(lián)合組細(xì)胞形態(tài)都由長(zhǎng)梭形逐漸向短梭形、三角形、類(lèi)圓形轉(zhuǎn)變，細(xì)胞體積逐漸縮小，胞漿豐富。且Icaritin+GDF-5 聯(lián)合組(圖2D)最為明顯，GDF-5 組(圖2C)和淫羊藿素組(圖2B)次之，而對(duì)照組(圖2A)變化最小。連續(xù)誘導(dǎo)14 d 后，對(duì)照組(圖2A)并沒(méi)有明顯的蛋白聚糖染色，淫羊藿素組(圖2B)、GDF-5 組(圖2C)、Icaritin+GDF-5 聯(lián)合組(圖2D)Alcian Blue 染色后顏色由淺到深。說(shuō)明誘導(dǎo)后四組細(xì)胞分泌蛋白聚糖的量逐漸增加。

3.3 RT-PCR 結(jié)果

RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果分析表明，與對(duì)照組相比，Icaritin 組、GDF-5 組及Icaritin+GDF-5 聯(lián)合組軟骨標(biāo)記基因Aggrecan、Col2、Sox9 表達(dá)量均明顯增加(P＜0.05)，相反成骨分化相關(guān)基因Col1a1 表達(dá)量明顯減少(P＜0.05)，但是Icaritin 組Col1a1 表達(dá)量增加(P＜0.05)。與GDF-5 組比較，Icaritin+GDF-5聯(lián)合組Aggrecan、Col2、Sox9 基因表達(dá)量也增加(P＜0.05)，相應(yīng)的Col1a1 表達(dá)量下降(P＜0.05)(圖3)。

圖3 BMSCs 誘導(dǎo)14 d 后成軟骨分化相關(guān)基因的表達(dá)水平Fig.3 Gene relative expression level detected at day 14 after induction

圖4 BMSCs 誘導(dǎo)14 天后相關(guān)蛋白的表達(dá)水平Fig.4 Protein relative expression of COL2 and COL1 after 14 days of induction

3.4 Western Blot 檢測(cè)結(jié)果

Western Blot 檢測(cè)結(jié)果灰度分析表明，相比于BMSCs 組，各誘導(dǎo)組Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)量均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);相對(duì)于BMSCs+GDF-5 組，BMSCs+GDF-5+ICT 組Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)量增加(P＜0.05)。與BMSCs 組相比，BMSCs+ICT 組I 型膠原蛋白相對(duì)表達(dá)量增加(P＜0.05)，而B(niǎo)MSCs+GDF-5 組及BMSCs+GDF-5+ICT 組表達(dá)減少(P＜0.05);與BMSCs+GDF-5 組相比BMSCs+GDF-5+ICT 組I 型膠原蛋白表達(dá)減少(P＜0.05)(圖4)。

4 討論與結(jié)論

BMSCs 是一種多能干細(xì)胞，擁有強(qiáng)大的自我更新和良好的分化潛能，在一定的條件下，其可以向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞等分化［7］。由于它具有來(lái)源廣、易得到、易于培養(yǎng)擴(kuò)增、低免疫原性、能與軟骨下骨很好的融合［8］等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于軟骨組織工程。GDF-5 也被稱(chēng)為軟骨衍生形態(tài)發(fā)生蛋白-1(CDMP-1)，在胚胎發(fā)育階段能夠促進(jìn)肢體發(fā)育，參與肌腱、韌帶、神經(jīng)、皮膚、骨及軟骨損傷修復(fù)［9］。在肢體發(fā)育的早期，GDF-5 表達(dá)于軟骨基原的間充質(zhì)干細(xì)胞凝集區(qū);隨后它的表達(dá)僅局限于關(guān)節(jié)形成的中心區(qū)域，是滑膜關(guān)節(jié)的正常形態(tài)和發(fā)育所必須的［10］。此外，GDF-5 還表達(dá)于成年人關(guān)節(jié)軟骨組織中，參與軟骨表型和功能的維持［11］。有研究表明:GDF-5 能夠誘導(dǎo)干細(xì)胞成軟骨分化，增加其蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的表達(dá)［4］。

淫羊藿是一味傳統(tǒng)的中草藥，根據(jù)中國(guó)藥典記錄，我國(guó)人民采用該藥來(lái)壯骨強(qiáng)腎有幾千年的歷史，利用現(xiàn)代的藥物分析手段研究該藥的成分發(fā)現(xiàn):其主要的藥物成分為黃酮類(lèi)化合物，統(tǒng)稱(chēng)為淫羊藿總黃酮，進(jìn)一步的研究證明:淫羊藿總黃酮中主要的活性單體為淫羊藿苷，淫羊藿苷屬于具有戊二烯結(jié)構(gòu)的黃酮苷［12］。Zhang L 等［13］研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的合成和基因的表達(dá)，有利于軟骨細(xì)胞表型的維持。淫羊藿素(Icaritin，ICT)作為淫羊藿苷的衍生物，是其體內(nèi)代謝后的主要活性產(chǎn)物，與其前體物質(zhì)淫羊藿苷具有極其相似的分子結(jié)構(gòu)，具有抗氧化、防治骨質(zhì)疏松、促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖、治療心血管疾病、保護(hù)神經(jīng)變性損傷、防治乳腺癌等作用［14］。有研究表明:低濃度(4、8 μmol/L)的淫羊藿素能夠促進(jìn)大鼠軟骨細(xì)胞增殖抑制其凋亡［15］，而高濃度則沒(méi)有這個(gè)作用。本實(shí)驗(yàn)前期選用1、5、10、20 μmol/L 的ICT 分別聯(lián)合100 ng/mL 的GDF-5 誘導(dǎo)rBMSCs 分化，Alcian Blue 染色結(jié)果提示5 μmol/L 效果最好。因此，本實(shí)驗(yàn)采用5 μmol/L 的淫羊藿素聯(lián)合100ng/mL 的GDF-5 誘導(dǎo)rBMSCs 成軟骨分化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明5 μmol/L 淫羊藿素的淫羊藿素具有促進(jìn)GDF-5 誘導(dǎo)的細(xì)胞合成和分泌蛋白多糖，促進(jìn)Aggrecan、Col2、Sox9 mRNA表達(dá)，促進(jìn)Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)抑制Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)。其中蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白是透明軟骨細(xì)胞分泌的特異性的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，Sox9是一種高遷移率族蛋白(HMG-box)轉(zhuǎn)錄因子，是間質(zhì)祖細(xì)胞成軟骨分化早期階段的標(biāo)志［16］。成軟骨分化標(biāo)記基因Aggrecan、Col2、Sox9 mRNA 及Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)量明顯增加提示GDF-5 聯(lián)合ICT 能夠誘導(dǎo)BMSCs 向軟骨軟骨細(xì)胞分化。與單獨(dú)GDF-5組相比，添加ICT 組上述基因和蛋白表達(dá)水平明顯增加(差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，說(shuō)明淫羊藿素體外能夠促進(jìn)rBMSCs 成軟骨分化。此外，淫羊藿素能夠?qū)刖垡蚁?磷酸三鈣(PLGA-TCP)形成新的多孔復(fù)合支架，它能持續(xù)釋放ICT，并且有很好的生物相容性［17］，有利于ICT 用于軟骨損傷的治療的應(yīng)用。

綜上所述，GDF-5 聯(lián)合淫羊藿素能夠誘導(dǎo)rBMSCs 成軟骨分化，其中5 μmol/L 淫羊藿素能夠促進(jìn)GDF-5 誘導(dǎo)的細(xì)胞成軟骨分化，為應(yīng)用ICT 治療軟骨損傷提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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