陳金蓮，劉 凱，苗翠萍，官會林，趙立興*，孫世中*

1 云南師范大學(xué)能源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，昆明 650092;2云南大學(xué)省微生物研究所 教育部微生物多樣性可持續(xù)利用重點實驗室，昆明 650091

木霉菌屬絲孢目(Moniliales)叢梗孢科(Moniliaceae)木霉屬(Trichoderma)真菌，是典型的絲狀真菌，具有較強環(huán)境適應(yīng)能力，易于生長繁殖，在各種環(huán)境中有著廣泛的分布與種群有優(yōu)勢，尤其在森林與農(nóng)業(yè)土壤環(huán)境中極易分離得到［1］。木霉菌具有重寄生、分泌胞外酶降解病原真菌細胞壁、產(chǎn)生抑菌活性次生代謝產(chǎn)物等生物學(xué)特性，木霉菌作為生物防治菌劑在全球農(nóng)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用已取得矚目的成效［2］。

微生物產(chǎn)生的具有鐵離子螯合活性的次生代謝產(chǎn)物即鐵載體(siderophores)對依賴鐵離子的病原菌有顯著抑制作用［3］，鐵載體通路已成為抑制病原菌的潛在新靶標(biāo)。Vinale 等［4］人從哈茨木霉(Trichoderma harzianum)代謝產(chǎn)物中還發(fā)現(xiàn)了一個對馬鈴薯具有促生作用的新型鐵載體化合物harzianic acid。自然環(huán)境中許多微生物具有產(chǎn)生鐵載體成分的能力，其具體功能與作用已獲得了階段性的闡釋［5］，微生物鐵載體活性成分的研究對藥物研發(fā)與農(nóng)業(yè)種植有著重要意義。

擬康氏木霉Trichoderma koningiopsis YIMPH 30002 分離自健康三七(Panax notoginseng)植物，通過雙層瓊脂平板法與發(fā)酵粗提物的鐵載體活性檢測，發(fā)現(xiàn)其在PDB 培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出對鐵離子較強的螯合活性。從其發(fā)酵液的乙酸乙酯粗提物中分離得到5 個聚酮類化合物，經(jīng)波譜解析分別鑒定為:konginginin A(1)、konginginin B(2)、konginginin D(3)、konginginin F(4)、konginginin M(5)。對單體化合物進行了抑菌與鐵載體活性分析，化合物均無明顯抑菌活性，但化合物2 的鐵離子螯合活性相對較強。

1 儀器與材料

1.1 菌株來源

菌株YIM PH30002 分離于三七植物的莖部，綜合其ITS 基因序列(GenBank 登錄號:KM 190127)系統(tǒng)發(fā)育分析與形態(tài)學(xué)特征觀察結(jié)果，確定為擬康氏木霉菌(Trichoderma koningiopsis YIM PH30002)。標(biāo)本菌株保存于云南大學(xué)省微生物研究所菌種保藏庫。

1.2 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200.0，葡萄糖15.0，瓊脂12.0，蒸餾水，液體培養(yǎng)基(PDB)不加瓊脂。改良馬丁培養(yǎng)基(g/L):K2HPO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，蔗糖10.0，蛋白胨5.0，酵母浸膏2.0，瓊脂12.0，蒸餾水，液體培養(yǎng)基不加瓊脂。察氏培養(yǎng)基(g/L):蔗糖30.0，NaNO32.0，K2HPO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，瓊脂12.0，蒸餾水，液體培養(yǎng)基不加瓊脂。LB 培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10.0，酵母膏5.0，NaCl 10.0，蒸餾水，pH 7.2-7.4。

1.3 主要儀器與試劑

柱色譜硅膠(200～300 目)和GF254薄層色譜硅膠板均由青島海洋化工有限責(zé)任公司生產(chǎn);Sephadex LH-20 為瑞典GE Healthcare Bio-Sciences AB 公司生產(chǎn);MCI gel(75～150 μm)為英國Hichrom 公司生產(chǎn);分析型與半制備型HPLC 為安捷倫1200 Series，色譜柱為Phenomenex C18(250 mm×4.60 mm，5 μm)與YMC C18(250 mm×10 mm，5 μm)柱;核磁共振波譜由Bruker AV-400 和DRX-500 測定，TMS(四甲基硅烷)為內(nèi)標(biāo);質(zhì)譜分析由Agilent G3250AA spectrometer 質(zhì)譜儀測定;顯色方法為熒光燈下波長254 nm 和365 nm 處觀察熒光，碘蒸氣顯色與硫酸茴香醛處理后加熱顯色;分析純試劑石油醚，乙酸乙酯，丙酮，氯仿，甲醇由天津化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);色譜純甲醇由德國Merck 公司生產(chǎn);鐵載體活性檢測試劑CAS 溶液:首先將60.5 mg 鉻天青S(Chrome azurol S，CAS)，溶解于50 mL 去離子水中，加入10 mL Fe3+溶液(1 mM FeCl3·6H2O，10 mM HCl)混勻后，記為“A 液”;其次稱取72.9 mg 十六氨基烷基溴化銨(HTDMA)溶解于40 mL 去離子水中，加熱充分溶解后，記為“B 液”;最后將A 液與B 液緩慢混合搖勻后得到CAS 檢測溶液。

1.4 鐵載體活性檢測

菌株YIM PH30002 產(chǎn)鐵載體固體平板檢測參照文獻［6，7］，采用雙層瓊脂法，上層為培養(yǎng)基(分別為PDA、改良馬丁、察氏3 種)，下層為添加有4 %的CAS 溶液的水瓊脂，用直徑為5 mm 的打孔器從YIM PH30002 菌株平板內(nèi)移取菌塊接入雙層平板中央，接種后放置28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，觀察菌落周圍特征暈圈顏色變化。菌株YIM PH30002 在以上3 種液體培養(yǎng)基的發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物鐵載體活性成分檢測參照文獻［8］，將粗提物用甲醇溶解，粗提物的濃度檢測范圍設(shè)置為10～1000 μg/mL，按等體積比與CAS 溶液加入96 孔板內(nèi)，反應(yīng)總體系80 μL，以溴化十六烷基三甲銨(CTAB)作為陽性對照，甲醇作為陰性對照，每個處理設(shè)三個重復(fù)，并同時觀察特征顏色變化，將能引起CAS 檢測液出現(xiàn)特征顏色變化時的粗提物濃度記為最小檢測濃度(Minimum test concentration，MTC)值。單體化合物鐵載體活性的MTC 值測定同粗提物的檢測方法與步驟一致。

1.5 發(fā)酵與提取分離

將菌株接種斜面活化培養(yǎng)5 d，接種于500 mL錐形瓶中(含有150 mL PDB 培養(yǎng)基)置搖床上130 rpm，28 ℃培養(yǎng)3 d;將種子培養(yǎng)液按8%～10%(v/v)接種量接于發(fā)酵培養(yǎng)基(PDB)中，置搖床上130 rpm，28 ℃培養(yǎng)10 d，共發(fā)酵50 L。發(fā)酵后用紗布過濾分離發(fā)酵液與菌絲體。用等體積的乙酸乙酯萃取發(fā)酵液三次，合并提取液，并真空濃縮蒸干，菌絲體使用過量丙酮浸泡并超聲破壁15 min，用等體積的乙酸乙酯萃取丙酮提取物三次并濃縮蒸干。兩部分萃取物經(jīng)TLC 和HPLC 檢測分析后合并得到總浸膏43.6 g。粗提物用等體積比的石油醚相與甲醇/水相(9∶1，v/v)溶解分離萃取3 次，甲醇/水相經(jīng)真空濃縮蒸干后，經(jīng)正向硅膠色譜，以氯仿/甲醇(1∶0、100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1，v/v)梯度洗脫得到六個組分(Fr.1～6)。其中組分Fr.1 經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜以甲醇洗脫，得到四個組分(Fr.1.1～1.4)，其中Fr.1.2 進一步經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜以甲醇洗脫得到化合物2，konginginin B(20.1 mg)，F(xiàn)r.1.2 剩余組分經(jīng)硅膠柱色譜以石油醚/丙酮(10∶1-5∶1)梯度洗脫得到化合物1，konginginin A(18.1 mg)，F(xiàn)r.1.1 組分經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜以甲醇洗脫后經(jīng)硅膠柱色譜以石油醚/丙酮(10∶1～1∶1)梯度洗脫得到化合物5，konginginin M(14.3 mg)。組分Fr.2 經(jīng)MCI 柱色譜以甲醇/水(10%～100%)梯度洗脫得到三個組分Fr.2.1～Fr.2.3，其中組分Fr.2.1 經(jīng)半制備HPLC 以甲醇/水(10%～100%)作為流動相梯度洗脫，流速為3.0 mL/min，分別得到化合物3，konginginin D(7.5 mg)和4，konginginin F(8.6 mg)。

1.6 抑菌活性分析

單體化合物抗菌活性分析參照文獻［9］，采用微量稀釋法于96 孔板分析單體化合物的最小抑菌濃度(MIC)值?；衔镆远谆鶃嗧?DMSO)溶解，采用二倍連續(xù)稀釋法將化合物檢測濃度范圍設(shè)置為1～256 μg/mL，DMSO 在每個孔中的終濃度小于5%;以鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumanii)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)為病原指示細菌，用LB 培養(yǎng)基將細菌在37 ℃培養(yǎng)18 h 后使菌落數(shù)為1×105units/mL;以尖孢鐮孢菌(Fusarium oxysporum)、人參鏈格孢(Alternaria panax)、腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)為病原指示真菌，用PDB 培養(yǎng)基將真菌在28 ℃培養(yǎng)24 h 后使菌落數(shù)為1×103units/mL;卡那霉素與制霉菌素分別作為抗細菌與真菌的陽性對照，DMSO 作為陰性對照;每個處理設(shè)三個重復(fù)，最后將接有細菌的板放置37 ℃培養(yǎng)24 h，接有真菌的96 孔板置28 ℃培養(yǎng)36 h 后，置顯微鏡下觀察記錄，最終將觀察到孔中無菌體生長時所在化合物濃度定為該化合物的最小抑制濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 鐵載體活性

采用由真菌常用的培養(yǎng)基與通用CAS 檢測平板構(gòu)成的雙層平板，擬康氏木霉菌YIM PH30002 能在上層的3 種不同培養(yǎng)基上生長良好，且在下層的CAS 檢測平板上能夠形成典型的鐵載體螯合暈圈。從表1 結(jié)果可看出菌株YIM PH30002 在上層為PDA 培養(yǎng)基時所產(chǎn)生的鐵載體特征暈圈大于在察氏與改良馬丁培養(yǎng)基所形成的暈圈，且菌株在察氏培養(yǎng)基中產(chǎn)鐵載體能力相對最弱;對菌株YIM PH30002 產(chǎn)鐵載體形成的特征型螯合暈圈進行半定量分析，結(jié)果見表1，由于菌株在PDA 培養(yǎng)基生長速度最快，相應(yīng)的鐵載體螯合暈圈較大，因此，在鐵載體螯合暈圈與菌落的直徑比值上最大，由此可知，菌株YIM PH30002 在PDA 培養(yǎng)基上生長時，產(chǎn)鐵載體能力最強。菌株YIM PH30002 在3 種不同培養(yǎng)基液體發(fā)酵的萃取粗提物鐵載體檢測分析結(jié)果見表2，由于CTAB 是最常用的金屬離子螯合劑，所以將其作為陽性對照，CTAB 引起CAS 檢測液出現(xiàn)特征顏色變化的 MTC 值為10 μg/mL;菌株 YIM PH30002 在察氏與改良馬丁培養(yǎng)基發(fā)酵液中萃取的粗提物引起CAS 檢測液出現(xiàn)特征顏色變化的MTC值分別為150 μg/mL 和100 μg/mL，而PDB 培養(yǎng)基發(fā)酵液萃取粗提物的MTC 值為50 μg/mL，與平板法檢測結(jié)果一致，因此MTC 值可以作為微生物產(chǎn)鐵載體能力的定量分析?；衔?～5 對鐵離子螯合活性的MTC 值分析結(jié)果見表2，結(jié)果表明，化合物5在濃度即使大于1000 μg/mL 時也未能引起CAS 檢測液出現(xiàn)特征顏色變化，即無鐵載體活性，化合物2的鐵載體活性相對化合物1、3 和4 較強，其MTC 值為300 μg/mL。

表1 YIM PH30002 在3 種培養(yǎng)基產(chǎn)鐵載體比較Table 1 Comparison of siderophores produced by strain YIM PH30002 in three medium

表2 YIM PH30002 不同發(fā)酵液的粗提物與化合物1～5 的鐵載體活性Table 2 The siderophores activities of the crude extracts and compounds 1-5

圖1 化合物1～5 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1-5

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物(1)Koninginin A，無色油狀，C16H28O4;HR-ESI-MS m/z:307.1913［M+Na］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:4.32(1H，s，H-9)，4.03(1H，m，H-10)，3.89(1H，dd，J=11.2，2.4Hz，H-1)，3.62(1H，m，H-4)，2.25(1H，m，H-8a)，1.58(1H，m，H-8b)，1.97(1H，m，H-3a)，1.82(1H，m，H-3b)，1.88(1H，m，H-2a)，1.52(1H，m，H-2b)，1.72(1H，m，H-7a)，1.61(1H，m，H-7b)，1.60(1H，m，H-6)，1.57(2H，m，H-11)，1.30(2H，m，H-14)，1.28(2H，m，H-13)，1.28(2H，m，H-15)，1.27(2H，m，H-12)，0.88(3H，t，J=6.0Hz，H-16);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:109.2(C-5)，79.4(C-10)，79.1(C-9)，72.7(C-4)，69.9(C-1)，41.4(C-6)，35.2(C-11)，31.7(C-14)，30.8(C-2)，29.1(C-13)，27.3(C-8)，25.6(C-3)，25.2(C-12)，22.5(C-15)，20.6(C-7)，14.0(C-16)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻［10］報道一致。確定該化合物為koninginin A。

化合物(2)Koninginin B，無色油狀，C16H26O4;HR-ESI-MS m/z:305.1773［M+Na］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:4.04(1H，dd，J=13.2，5.2 Hz，H-2)，3.87(1H，s，2-OH)，3.78(1H，m，H-9)，3.64(1H，br s，10-OH)，3.77(1H，m，H-10)，2.56(1H，m，H-4a)，2.08(1H，m，H-4b)，2.35(1H，m，H-3a)，1.80(1H，m，H-3b)，1.95(1H，m，H-7a)，1.66(1H，m，H-7b)，1.65(1H，m，H-8a)，1.55(1H，m，H-8b)，1.35(2H，m，H-12)，1.33(2H，m，H-11)，1.30(1H，m，H-13)，1.31(2H，m，H-14)，1.29(2H，m，H-15)，0.87(3H，t，J=7.2Hz，H-16);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:198.5(C-1)，171.8(C-5)，109.5(C-6)，81.2(C-9)，73.5(C-10)，71.4(C-2)，33.2(C-4)，32.2(C-11)，29.7(C-14)，29.4(C-13)，27.6(C-3)，25.8(C-8)，23.1(C-12)，23.0(C-15)，18.1(C-7)，14.5(C-16)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻［11］報道一致。確定該化合物為koninginin B。

化合物(3)Koninginin D，無色油狀，C16H26O5;HR-ESI-MS m/z:321.1792［M+Na］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:4.66(1H，br s，H-7)，4.45(1H，m，H-4)，4.10(1H，m，H-9)，3.72(1H，m，H-10)，2.64(1H，m，H-2a)，2.37(1H，m，H-2b)，2.23(1H，m，H-3a)，2.01(1H，m，H-3b)，1.97(1H，m，H-8a)，1.77(1H，m，H-8b)，1.60(2H，m，H-12)，1.58(1H，m，H-11a)，1.48(1H，m，H-11b)，1.31(2H，m，H-13)，1.30(2H，m，H-14)，1.30(2H，m，H-15)，0.89(3H，t，J=7.2Hz，H-16);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:198.5(C-1)，171.1(C-5)，114.2(C-6)，77.4(C-9)，73.1(C-10)，65.7(C-4)，57.3(C-7)，33.1(C-2)，32.8(C-11)，31.7(C-14)，30.9(C-13)，29.2(C-8)，28.8(C-3)，25.2(C-12)，22.6(C-15)，14.0(C-16)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻［11］報道一致。確定該化合物為koninginin D。

化合物(4)Koninginin F，無色油狀，C16H26O5;HR-ESI-MS m/z:321.1797［M+Na］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:4.80(1H，br s，H-7)，4.08(1H，m，H-9)，4.06(1H，m，H-2)，3.69(1H，s，H-10)，2.62(1H，m，H-4a)，2.37(1H，m，H-4b)，2.35(1H，m，H-3a)，1.98(1H，m，H-3b)，1.97(1H，m，H-8a)，1.80(1H，m，H-8b)，1.62(2H，m，H-11)，1.51(2H，m，H-12)，1.31(2H，m，H-13)，1.30(2H，m，H-14)，1.29(2H，m，H-15)，0.88(3H，t，J=7.0Hz，H-16);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ:198.3(C-1)，173.5(C-5)，112.6(C-6)，77.3(C-9)，72.8(C-10)，71.0(C-2)，57.2(C-7)，33.1(C-4)，31.7(C-11)，31.4(C-14)，29.2(C-13)，28.6(C-8)，27.1(C-3)，25.4(C-12)，22.6(C-15)，14.0(C-16)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻［12］報道一致。確定該化合物為koninginin F。

化合物(5)Koninginin M，無色油狀，C16H24O4;HR-ESI-MS m/z:303.1620［M+Na］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:4.99(1H，d，J=5.6 Hz，H-7)，4.83(1H，br s，H-9)，4.05(1H，m，H-10)，3.94(1H，dd，J=7.9，5.2 Hz，H-2)，3.81(1H，br s，2-OH)，2.53(2H，m，H-4)，2.35(1H，m，H-3a)，1.83(1H，m，H-3b)，1.64(1H，m，H-11a)，1.48(1H，m，H-11b)，1.30(2H，m，H-12)，1.30(2H，m，H-13)，1.28(2H，m，H-14)，1.28(2H，m，H-15)，0.88(3H，t，J=7.2Hz H-16);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ:194.8(C-1)，173.8(C-5)，116.1(C-6)，85.9(C-10)，79.5(C-9)，70.9(C-2)，66.2(C-7)，32.5(C-8)，31.7(C-11)，31.6(C-14)，29.2(C-13)，29.0(C-3)，26.4(C-4)，26.3(C-12)，22.5(C-15)，14.1(C-16)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻［13］報道一致，確定該化合物為koninginin M。

2.3 抑菌活性

抑菌活性分析結(jié)果(表3)表明，化合物1～5 對檢測的病原指示真菌無顯著的抑菌活性，MIC 值范圍為128～256 μg/mL，而對病原指示細菌無抑菌活性，其MIC 值均大于256 μg/mL。

表3 化合物(1～5)對微生物的最小抑制濃度(MICs)Table 3 Minimal inhibitory concentration of compounds(1-5)against tested microorganisms

2.4 討論

鐵元素是大部分微生物生長的必須元素，真菌、細菌能通過自身代謝產(chǎn)生對環(huán)境中鐵離子具有螯合活性的化合物［5］，CAS 平板法已被廣泛用于微生物產(chǎn)鐵載體潛能檢測［14］。鐵離子、CAS 和HTDMA 會絡(luò)合形成藍色復(fù)合物(FeDye3-x)其具體顯色原理可用化學(xué)式:FeDye3-x+Ly-→FeL3-y+Dyex-表示，當(dāng)對Fe3+具有更高親和力的配體(L)出現(xiàn)，如將鐵載體加入FeDye3-x 藍色復(fù)合物中，復(fù)合物中的鐵離子便會轉(zhuǎn)移到配體上，而釋放出染料，此時溶液的顏色由藍色變?yōu)辄S色、紫色或橙色。因此用雙層瓊脂平板法可在平板上觀察到典型鐵載體顏色暈圈，微生物代謝提取物與CAS 溶液的理化反應(yīng)同樣可通過特征顏色變化來判斷化合物鐵離子螯合強度。本文研究發(fā)現(xiàn)菌株YIM PH30002 在三種不同培養(yǎng)基中產(chǎn)鐵載體能力存在差異，其在PDA 培養(yǎng)基上特征顏色暈圈最大。鐵載體特征螯合暈圈與菌落直徑比值作為產(chǎn)鐵載體能力的一種半定量分析方法［15］，與菌株YIM PH30002 在三種不同液體培養(yǎng)基發(fā)酵液的提取物與CAS 檢測液的理化反應(yīng)的定量分析方法結(jié)果一致。微生物所產(chǎn)鐵載體是一類較特殊的天然產(chǎn)物，近年來圍繞微生物所產(chǎn)鐵載體的功能與機制等方面引發(fā)了廣泛討論:研究發(fā)現(xiàn)阻斷結(jié)核桿菌鐵載體循環(huán)通路可誘發(fā)自毒效應(yīng)，即內(nèi)源鐵載體物質(zhì)積累導(dǎo)致結(jié)合桿菌死亡，這為結(jié)核病藥物的研發(fā)提供了新的靶標(biāo)［16］;研究還表明微生物產(chǎn)生鐵載體可促進植物生長［17］，抑制病原菌等作用［18］。本文首次報道三七內(nèi)生真菌擬康氏木霉菌YIM PH30002具有產(chǎn)鐵載體的能力，并發(fā)現(xiàn)了部分化合物具有一定的鐵載體活性，但未能發(fā)現(xiàn)具有極強鐵離子螯合活性的單體，這與粗提物顯示的螯合活性存在差異，可能與化合物間的協(xié)同作用有一定關(guān)聯(lián)，有關(guān)菌株YIM PH30002 分泌的鐵載體代謝產(chǎn)物對鐵離子的協(xié)同螯合作用機制值得進一步深入研究。

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