申 潔，柴 青(延安市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，延安 76000;西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院全科;通訊作者，E-mail:4708985@qq．com)

結(jié)核病是全球嚴重的公共衛(wèi)生問題之一。據(jù)WHO估計，全球有約20億人感染結(jié)核分支桿菌，每年有約200萬人死于結(jié)核［1］。中國是22個結(jié)核病高負擔國家之一［2］。結(jié)核性胸膜炎是胸腔積液的常見原因，在我國胸腔積液住院患者中結(jié)核性胸腔積液占到 49．5%-54．5%［3］。目前結(jié)核性胸膜炎診斷缺乏特異性手段，實際臨床工作中，以臨床綜合診斷為主。T細胞斑點試驗(T cell enzyme-linked immunospot，T-SPOT．TB)由酶聯(lián)免疫斑點(enzymelinked immunospot assay，ELISPOT)技術(shù)發(fā)展而來，結(jié)核菌感染后體內(nèi)長期存在特異性T細胞，當再次遇到抗原刺激時，能迅速活化增殖，釋放γ-干擾素。早期分泌靶抗原6(early secreted antigenic target 6，ESAT-6)和培養(yǎng)濾過蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP-10)是結(jié)核分支桿菌的特異靶抗原，ELISPOT通過聯(lián)合使用結(jié)核菌特異性抗原ESAT-6和CFP-10，降低與BCG疫苗和多種環(huán)境分支桿菌的交叉反應(yīng)，從而提高釋放γ-干擾素的特異效應(yīng)性T細胞的檢出率［4］。本研究主要是對臨床確診結(jié)核性胸膜炎與非結(jié)核性胸膜炎患者T-SPOT．TB結(jié)果進行研究分析，評價該方法對結(jié)核性胸膜炎的診斷價值。

1 資料與方法

1．1 研究對象

收集2013-01～2014-06延安市人民醫(yī)院和西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科、胸外科、腫瘤科、傳染科住院311例按Light標準診斷為滲出性胸膜炎患者。

按照胸腔積液是否為結(jié)核性胸腔積液將311例患者分為:①結(jié)核性胸腔積液組(實驗組):均為實驗室細菌學或組織學確診病例或臨床診斷結(jié)核性胸腔積液經(jīng)診斷性抗結(jié)核治療隨訪2月治療有效者。②非結(jié)核性胸腔積液組(對照組):組織病理學確診惡性胸腔積液者，臨床診斷肺炎旁積液或膿胸抗感染治療胸水吸收者，確診風濕性疾病引起的胸腔積液者，排除結(jié)核合并腫瘤者，排除結(jié)核合并膿胸者。

結(jié)核性胸腔積液組共182例，其中男性125例，女性57例，平均年齡(42．8±19．3)歲。非結(jié)核性胸腔積液組共129例，其中男性85例，女性44例，平均年齡(58．8 ±16．3)歲。

1．2 儀器與試劑

生物安全柜(青島海爾生物公司)，CO2培養(yǎng)箱(上海力申科學儀器有限公司)，T-SPOT．TB試劑盒(牛津Immunotec公司，英國)和BD單個核細胞分離器。

1．3 方法

1．3．1 T-SPOT．TB檢測方法 肝素抗凝管采集靜脈血4 ml，立即顛倒數(shù)次，充分混勻，以免血液凝固。樣本采集后盡快進行外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的分離，用細胞培養(yǎng)基AIM-V重懸細胞，并將濃度調(diào)整至2．5×106/ml。從鋁封袋中拿出96孔的培養(yǎng)板(使用抗γ-IFN單抗包被)，在陰性對照孔中標記且按一定順序加入50 μl AIM-V，在 A 孔中加入 50 μl ESAT-6(抗原A)，在 B孔中加入50 μl CFP-10(抗原 B)，使得兩種抗原的最終濃度為10 μg/ml，再將陽性對照孔中加入50 μl植物血凝素;將已制備細胞稀釋液100 μl(含250 000個細胞)分別加入陰性對照孔、陽性對照孔、A孔及B孔當中，然后將準備好的培養(yǎng)板放入37℃CO2培養(yǎng)箱孵育16-20 h;配制堿性磷酸酶標記的二抗;16-20 h后，從37℃CO2培養(yǎng)箱中取出96孔培養(yǎng)板，使用新鮮無菌的PBS液200 μl洗板4次;將培養(yǎng)板加入酶標抗體工作液50 μl后，用保鮮膜將培養(yǎng)板包好，放入4℃冰箱中再次孵育1 h。再次使用PBS洗滌4遍用于清除未結(jié)合酶標，50 μl底物工作液分別加入96孔，在室溫溫度下反應(yīng)，反應(yīng)過程中需避光，反應(yīng)時間為7 min，反應(yīng)結(jié)束后使用蒸餾水反復沖洗培養(yǎng)板以終止反應(yīng)，最后在37℃2-3 h干燥培養(yǎng)板。待培養(yǎng)板干燥后，利用斑點計數(shù)儀進行計數(shù)。

1．3．2 結(jié)果判定 試驗有效判定標準:試驗設(shè)有陰性對照、陽性對照，ESAT-6和CFP-10作為兩個實驗孔，當計數(shù)結(jié)果為陰性對照孔內(nèi)斑點數(shù)＜10、陽性對照孔內(nèi)斑點數(shù)＞20時，判定實驗結(jié)果有效。

陽性判定標準:當陰性對照孔內(nèi)斑點數(shù)＜6時，且任何一個實驗孔斑點數(shù)減去空白對照孔斑點數(shù)后≥6，則實驗結(jié)果可判定為陽性。當陰性對照孔內(nèi)斑點數(shù)＞6，且任何一個實驗孔斑點數(shù)大于陰性對照孔斑點數(shù)的2倍，則實驗結(jié)果可判定為陽性。

陰性判定標準:如若出現(xiàn)實驗有效、陽性對照孔結(jié)果良好，但ESAT-6孔和CFP-10孔均達不到陽性標準的情況，則實驗結(jié)果仍然判定為陰性。

1．3．3 統(tǒng)計學分析 首先將入選患者所有臨床資料及T-SPOT．TB檢測結(jié)果輸入Excel表，建立數(shù)據(jù)庫，依據(jù)四格表法計算T-SPOT．TB在結(jié)核性胸膜炎中的靈敏度(Sn)、特異性(Sp)、陽性預測值(PPV)、陰性預測值(NPV)、陽性似然比(LR+)、陰性似然比(LR-)。

2 結(jié)果

2．1 一般資料

實驗組182例患者中僅12例胸水查見抗酸桿菌為陽性，45例患者行胸膜組織病理活檢找到多核巨細胞或呈肉芽腫改變，6例患者行胸腔鏡檢查鏡下表現(xiàn)，符合結(jié)核干酪樣改變，其余119例則為臨床上診斷的結(jié)核性胸膜炎。對照組129例患者，惡性胸腔積液73例均為病理診斷惡性胸腔積液，其中肺腺癌39例，肺鱗癌7例，肺小細胞癌9例，胸膜間皮瘤8例，淋巴瘤4例，肺外轉(zhuǎn)移癌6例;肺炎旁積液41例;膿胸8例;結(jié)締組織病引起的胸腔積液7例。

2．2 T-SPOT．TB 試驗結(jié)果

本項研究患者共311例，均進行外周血 TSPOT．TB檢測，檢測結(jié)果見表1。實驗組182例，其中陽性為160例，陰性為22例;對照組為129例，其中陽性者為25例，陰性者為104例。T-SPOT．TB試驗診斷結(jié)核性胸膜炎的靈敏度為86．5%，特異度為82．5%，陽性預測值為 87．9%，陰性預測值為80．6%，陽性似然比為4．95，陰性似然比為0．16。

表1 結(jié)核性胸腔積液患者與T-SOPT．TB篩查結(jié)果的關(guān)系Table 1 T-SOPT．TB results of pleural effusion in patients with tuberculous pleurisy and non-tuberculous pleurisy

2．3 ESAT-6和CFP-10結(jié)果比較

在結(jié)核性胸膜炎診斷中ESAT-6的靈敏度為77．5%，特異度為 85．3%，陽性預測值為 88．1%，陰性預測值為72．8%，陽性似然比為5．27，陰性似然比為0．26。CFP-10的靈敏度為79．1%，特異度為83．7%，陽性預測值為87．2%，陰性預測值為74．0%， 陽性似然比為4．85，陰性似然比為0．25(見表2)。

表2 ESAT-6、CFP-10、T-SPOT．TB篩查結(jié)核性胸膜炎的診斷效能Table 2 Diagnostic efficiency of ESAT-6，CFP-10 and T-SPOT．TB in sceening tuberculous pleurisy

3 討論

由于近年來結(jié)核病疫情呈明顯回潮，結(jié)核病已經(jīng)成為全世界成年人的主要死亡原因之一。眾所周知，細胞免疫反應(yīng)和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)是結(jié)核病的免疫學應(yīng)答中的兩種形式。體內(nèi)巨噬細胞、CD4+T淋巴細胞(Th)、結(jié)核桿菌特異性抗原以及相關(guān)細胞因子(CK)等多因素共同作用，導致了結(jié)核病的感染與發(fā)病，這一觀點已被眾多研究所證實［5］。結(jié)核桿菌首次感染機體引發(fā)致敏后，機體內(nèi)的T淋巴細胞轉(zhuǎn)化成記憶T淋巴細胞，能在機體的免疫系統(tǒng)內(nèi)存在相當長一段時間。當人體再次被結(jié)核分支桿菌入侵感染時，機體內(nèi)原先存在的記憶T淋巴細胞遭特異性抗原的再次刺激，隨之釋放出分子信號，并增殖轉(zhuǎn)變?yōu)樾?yīng)T淋巴細胞。效應(yīng)T淋巴細胞在MTB特異性抗原刺激下，多種細胞因子被分泌釋放出來，如巨噬細胞激活因子、白介素-23(IL-23)、白介素-2(IL-2)、腫瘤壞死因子、IFN-γ等。其中，IFN-γ是抗結(jié)核感染免疫中的關(guān)鍵性細胞因子這一點被越來越多的研究所證實［6］。

由此可推斷，如果結(jié)核感染特異性效應(yīng)T淋巴細胞，在致病性結(jié)核分支桿菌特異性抗原刺激下分泌IFN-γ等相關(guān)細胞因子這一過程能成功重復。同時，ESAT-6、CFP-10的刺激作用會致使血液中的效應(yīng)T淋巴細胞分泌IFN-γ，如果某種檢測手法檢測捕獲IFN-γ以證明其存在，那么就可以從根本上證實存在著結(jié)核菌感染。T-SPOT．TB基于此項理論完成檢測。在此方法中，機體PBMCs受到ESAT-6和CFP-10這兩種致病性結(jié)核桿菌特異性抗原的刺激。如果存在結(jié)核現(xiàn)癥感染，則在體外的細胞培養(yǎng)階段，結(jié)核感染效應(yīng)T淋巴細胞與ESAT-6和CFP-10充分接觸，隨后分泌釋放出大量細胞因子。然后使用ELISPOT技術(shù)檢測獲得特異性細胞因子IFN-γ分泌水平，進而證實結(jié)核感染在機體中存在與否。由于環(huán)境中的非典型分支桿菌和卡介苗中均不含BD1基因序列，然而結(jié)核分支桿菌的RD1基因序列合成ESAT-6和CFP-10這兩種蛋白，而僅致病性MTB之中存在著BD1基因序列，所以將ESAT-6和CFP-10這兩種結(jié)核感染的特異性抗原做為刺激物來進行T-SPOT．TB試驗，保證了結(jié)核T細胞斑點試驗診斷結(jié)核的高度特異性。此外，因其單細胞水平、活細胞功能檢測、高靈敏度、高通量等諸多優(yōu)點，酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)(ELISPOT)成為了目前細胞免疫水平的最佳檢測技術(shù)，T-SPOT．TB的高度靈敏也從而得到有效保證，也是目前實驗室檢測T淋巴細胞反應(yīng)最靈敏的方法。

T-SPOT．TB一經(jīng)有關(guān)部門批準使用后，就被廣泛應(yīng)用于臨床上結(jié)核感染的篩查、結(jié)核病診斷、治療效果的評估，雖其不能明顯區(qū)分活動性結(jié)核和潛伏期結(jié)核，但在結(jié)核性診斷上仍有廣闊的前景［7］。本研究中的 T-SPOT．TB 試驗，使用包括ESAT-6和CFP-10蛋白在內(nèi)的兩種特異性抗原，對機體外周血單核細胞進行刺激，并應(yīng)用通過酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)(ELISPOT)檢測特異性細胞因子IFN-γ和分泌T細胞數(shù)量，綜合此兩項測試結(jié)果來判斷結(jié)核感染。

結(jié)核性胸膜炎是繼淋巴結(jié)核病活動性結(jié)核分支桿菌感染的第二常見的肺外病變。結(jié)核桿菌由近胸膜的原發(fā)病灶直接進入胸膜腔和經(jīng)過淋巴管或血行播散直接至胸膜腔是引起結(jié)核性胸膜炎感染的主要途徑。結(jié)核性胸膜炎臨床主要以兒童和青年多見，但也可發(fā)生于任何年齡，結(jié)核性胸膜炎是世界上最常見的單側(cè)胸腔積液病因，大約占30%-60%。臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱(以低熱為主)、患側(cè)胸痛、氣短、乏力、盜汗等癥狀。臨床上多需與類肺炎性胸腔積液、惡性胸腔積液、風濕性胸腔積液等各種原因相鑒別。胸水涂片抗酸桿菌陽性、胸水結(jié)核分支桿菌培養(yǎng)陽性及干酪性肉芽腫組織病理學檢測被認為是診斷結(jié)核性胸膜炎的金標準，由于胸水涂片和培養(yǎng)的陽性率較低，影像學缺乏特異性，有創(chuàng)病理檢查有一定局限性，所以臨床工作中結(jié)核性胸膜炎的診斷常常十分困難。

本項研究結(jié)果提示T-SPOT．TB在結(jié)核性胸膜炎的診斷中敏感性高，特異度強。說明T細胞斑點試驗在結(jié)核性胸膜炎與非結(jié)核性胸膜炎的鑒別診斷中具有較好的作用。

意大利 Losic等［7］使用 T-SPOT．TB 試劑盒，對胸液及全血的單個核細胞經(jīng)抗原刺激后的SFCS進行了檢測，胸液T-SPOT的靈敏度為95%，特異度為76%。Lee等［8］在128例(活動性結(jié)核病87例，結(jié)核病低危群113例)中同時進行ELISPOT檢查發(fā)現(xiàn)ELISPOT其靈敏度最高為96．6%。Kim等［9］隨診72例患者疑肺外結(jié)核患者，對他們進行T-SPOT．TB和PPD檢測，結(jié)果T-SPOT．T的靈敏度為97%，PPD的靈敏度為47%。本研究與國外研究相比較，靈敏度略低，特異性較高，但仍可提示外周血T-SPOT．TB對結(jié)核性胸膜炎的診斷及鑒別診斷有較高價值，研究靈敏度略低于國外考慮為我國是結(jié)核高風險國家，結(jié)核性胸膜炎的發(fā)病率明顯高于歐美發(fā)達國家，樣本量較國外研究大等諸多種原因所致。

國內(nèi)杜巖青等［10］對健康對照組、初診結(jié)核性胸膜炎組、惡性胸腔積組、非結(jié)核性胸膜炎組進行了結(jié)核桿菌涂片檢查、T-SPOT．TB、ADA、TB-Ab，T-SPOT．TB對結(jié)核性胸膜炎診斷的靈敏度為91．1%、特異度為90．6%、診斷準確率為91．3%。劉珍瓊等［11］對58 例受試者(32例結(jié)核性胸膜炎患者和26例非結(jié)核性胸膜炎患者)評價T-SPOT．TB結(jié)果，靈敏度為81．3%，特異度為92．3%，陽性預測值為92．7%，陰性預測值為80．0%。王陵等［12］對25例受試者(10例結(jié)核性胸膜炎和15例非結(jié)核性胸膜炎)進行T-SPOT．TB試驗，其靈敏度為90．0%，特異度為80．0%。王永生等［13］選取24例臨床和放射學可疑胸膜結(jié)核患者為實驗組、25例非結(jié)核性滲出性胸膜炎患者為對照組，分別對其胸水進行T-SPOT．TB試驗，實驗組陽性率為95．8%，對照組25例中T-SPOT．TB試驗陽性20%;胸水T-SPOT．TB試驗診斷結(jié)核性胸膜炎的靈敏度和特異度分別為95．8%和80%，陰性預測值為82．1%，陽性預測值為95．2%。韋海旭等［14］使用T-SPOT．TB、TST對實驗組24例結(jié)核性疾病患者和對照組28例非結(jié)核性疾病患者進行檢查，實驗組中T-SPOT．TB檢測陽性達20例，陽性率為83．3%;對照組28例患者中27例T-SPOT．TB為陰性，診斷率為96．4%。周樂亮等［15］對24例確診結(jié)核性腹膜炎的患者進行T-SPOT．TB檢查，其中T-SPOT．TB檢測陽性22例，T-SPOT．TB的靈敏度為92%。根據(jù)研究結(jié)核提示，T-SPOT．TB診斷TBP的靈敏度與結(jié)核菌素皮膚試驗、外周血結(jié)核抗體檢測、腹水腺苷脫氨酶測定結(jié)果進行比較，有統(tǒng)計學意義。17例患者被診斷為非結(jié)核性腹膜炎，行T-SPOT．TB檢查，結(jié)果為陽性4例，陰性13例，特異度為77%;TST皮試，陽性5例，陰性12例，TST皮試診斷TBP的特異度為70%;血清TB-Ab IgG檢測，陽性6例，陰性11例，血清TBAb IgG診斷TBP的特異度為79%。Liu等［16］對168例胸腔積液患者進行了前瞻性研究，胸腔積液TSPOT．TB檢測結(jié)果顯示其靈敏度為94．5%，特異度為76．1%。Zhang等［17］通過對167 例胸腔積液患者的前瞻性研究，同時應(yīng)用T-SPOT．TB檢測了患者胸腔積液和外周血，結(jié)果顯示T-SPOT．TB胸水的靈敏度和特異度明顯高于外周血，并且斑點數(shù)相比于外周血提高了3．6倍，研究結(jié)果表明，在結(jié)核性胸膜炎疾病診斷方面，胸水T-SPOT．TB具有更大的意義。本項研究結(jié)果中外周血T-SPOT．TB診斷靈敏度與上述國內(nèi)的同類研究大致相符，但與國外同類研究相比略低，特異度與國外的同類研究相比略高，這可能由于中國人群中基礎(chǔ)結(jié)核潛伏感染率較高所導致。ESAT-6、CFP-10是結(jié)核感染后特異性抗原抗體，檢測其在結(jié)核性胸膜炎中的診斷價值，兩者靈敏度、特異性無明顯差異，聯(lián)合檢查時即可提高靈敏度。

綜上所述，T-SPOT．TB試驗在診斷結(jié)核性胸膜炎時，靈敏度、特異度高。在鑒別結(jié)核性胸膜炎和非結(jié)核性胸膜炎方面也具有一定意義。外周血TSPOT．TB試驗操作簡便易行，24-48 h檢測結(jié)果即可回報。T-SPOT．TB的應(yīng)用不僅可使患者得到早期診斷，還可以給臨床醫(yī)師提供有力參考，指導臨床實踐，及時治療、避免誤診、節(jié)省醫(yī)療費用。但TSPOT．TB檢測試劑盒價格昂貴，檢測一次的費用大約需要500-600元，因此目前在我國沒有常規(guī)應(yīng)用于對結(jié)核病的篩查，在胸腔積液的診斷中，只用于對結(jié)核性胸膜炎和惡性胸腔積液難以鑒別時。

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