劉建群， 劉 健， 蔣 偉， 鐘國(guó)躍*

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330004；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與民族藥研究中心，江西南昌330004）

HPLC法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地鳳尾草中的3種活性成分

劉建群1， 劉 健1， 蔣 偉2， 鐘國(guó)躍2*

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330004；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與民族藥研究中心，江西南昌330004）

目的建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地鳳尾草中的蕨素C-3-O-葡萄糖苷、忍冬苷和野漆樹(shù)苷3種活性成分的含有量。方法鳳尾草甲醇提取液分析采用Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.15%甲酸水溶液，梯度洗脫；體積流量1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)258 nm和350 nm；柱溫30℃。結(jié)果蕨素C-3-O-葡萄糖苷、忍冬苷和野漆樹(shù)苷3種活性成分分別在0.025 0～1.60、0.054 0～3.45和0.238～15.2μg的測(cè)定范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系（r＞0.999），加樣回收率分別為101.0%（RSD 1.4%）、101.0%（RSD 1.8%）和101.6%（RSD 1.2%）。10個(gè)不同來(lái)源鳳尾草中的蕨素C-3-O-葡萄糖苷最高與最低含有量相差約15倍，忍冬苷含有量相差約8倍，而野漆樹(shù)苷含有量相差達(dá)25倍。結(jié)論該方法能同時(shí)測(cè)定鳳尾草中3種活性成分的含有量，而且其藥材質(zhì)量與產(chǎn)地關(guān)系較大。

HPLC法；鳳尾草；蕨素C-3-O-葡萄糖苷；忍冬苷；野漆樹(shù)苷

鳳尾草為鳳尾蕨科植物鳳尾草Pterismultifida Poir.的全草或根部，具有清熱解毒、涼血止血、消腫解毒等功效，在民間被用于治療肝炎、菌痢、淋濁、便血、扁桃體炎、癰腫瘡毒、濕疹等疾?。?］?！吨袊?guó)藥典》1977年版關(guān)于鳳尾草的功能與主治為清濕熱解毒、止血，用于治療痢疾、黃疸、肝炎、胃腸炎、乳腺炎、白帶、崩漏，外治外傷出血、燒傷、燙傷。另外，中藥部頒標(biāo)準(zhǔn)第5冊(cè)還收載了含鳳尾草的復(fù)方制劑尿感寧沖劑（標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)WS3-B-0949-91）。研究表明［2-5］，鳳尾草中主要含有黃酮類、萜類、甾醇類、揮發(fā)油、苯丙素類等成分，具有廣譜抗菌、抗腫瘤、抗病毒作用。筆者先前已從中分離鑒定出多個(gè)蕨素和黃酮類成分，如蕨素C 3-O-β-D-葡萄糖苷、黃酮類成分野漆樹(shù)苷和忍冬苷等［6-7］。其中，蕨素類化合物具有顯著的生理活性，如保肝、抗氧化、抗癌、促進(jìn)腸吸收、抗痙攣等［8-11］；忍冬苷具有理想的保肝和治療肝炎作用，以及抗菌、抗氧化、抗骨質(zhì)疏松、抗焦慮和抗炎等生物活性；野漆樹(shù)苷也有保肝、抗氧化、降血壓和心率、抑制神經(jīng)氨酸酶和抗流感等生物活性［7，12-13］。但是，《中國(guó)藥典》1977年版和衛(wèi)生部部頒標(biāo)準(zhǔn)關(guān)于鳳尾草只有形態(tài)和顯微鑒別，為提高其質(zhì)量控制水平，建立和完善相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定了多個(gè)產(chǎn)地鳳尾草中的蕨素C-3-O-葡萄糖苷、忍冬苷和野漆樹(shù)苷3種有效成分的含有量，以期為該藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)和標(biāo)準(zhǔn)制定奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑和材料 Agilent1200高效液相色譜儀，包括四元泵、柱溫箱、VWD檢測(cè)器和Agilent 1200色譜工作站（美國(guó)Agilent Technologies公司）；Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm，迪馬科技有限公司）；BS224S、BT25S電子天平 （精度分別為萬(wàn)分之一和十萬(wàn)分之一，德國(guó)Sartorius公司）；三氯甲烷、乙酸為分析純 （西隴化工股份有限公司）；甲醇、甲酸為分析純 （國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈為色譜純 （美國(guó)ACS公司）；雙蒸水 （自制）。蕨素C-3-O-葡萄糖苷、忍冬苷和野漆樹(shù)苷對(duì)照品 （自制，純度均≥98%）。鳳尾草藥材10批 （購(gòu)自重慶、四川、北京、江西等地），經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與民族藥研究中心鐘國(guó)躍教授鑒定為鳳尾蕨科植物鳳尾草Pterismultifida Poir.的全草或根部。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；乙腈-0.15%甲酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫 （0～5 min，5∶95～10∶90；5～10 min，10∶90～15∶85；10～20 min，15∶85；20～25 min，15∶85～25∶75；25～35 min，25∶75）；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)258（0～26 min）、350 nm（26～35 min）；柱溫30℃；進(jìn)樣量10μL。混合對(duì)照品和鳳尾草樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 鳳尾草樣品(A)和混合對(duì)照品(B)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC ch romatogram s of the Pteris multifida sample(A)and reference substances(B)

1.2.2 溶液配制

1.2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蕨素C-3-O-葡萄糖苷1.60 mg、忍冬苷3.45 mg和野漆樹(shù)苷對(duì)照品15.20 mg，置于10 m L量瓶中，甲醇溶解，定容，即得質(zhì)量濃度分別為0.160、0.345和1.520 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

1.2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取鳳尾草藥材粉末1 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷后用甲醇補(bǔ)足減少的質(zhì)量，0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系考察 精密吸取 “1.2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，分別稀釋0、2、8、16、64倍，進(jìn)樣10μL，在 “1.2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定。然后，以峰面積值為縱坐標(biāo)，對(duì)照品量 （μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程與線性范圍，見(jiàn)表1。由表可知，該方法呈良好的線性關(guān)系（r＞0.999）。

表1 回歸方程與線性范圍Tab.1 Regression equations and linear ranges

2.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取5份產(chǎn)自重慶龍池鎮(zhèn)的鳳尾草藥材各1 g，按 “1.2.2.2”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定樣品中蕨素C-3-O-葡萄糖苷、忍冬苷和野漆樹(shù)苷的峰面積。結(jié)果，這3個(gè)成分的RSD（n= 5）分別為1.9%、1.5%、0.8%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液 （蕨素C-3-O-葡萄糖苷0.160 mg/mL、忍冬苷0.345 mg/mL、野漆樹(shù)苷1.520 mg/mL）10μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積。結(jié)果，樣品中這3個(gè)成分的RSD（n=5）分別為1.4%、1.6%、1.8%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取5份產(chǎn)自重慶龍池鎮(zhèn)的鳳尾草藥材各1 g，按 “1.2.2.2”項(xiàng)下方法操作，室溫放置 0、2、4、6、8、12、24 h后在“1.2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定。結(jié)果，樣品中蕨素C-3-O-葡萄糖苷、忍冬苷和野漆樹(shù)苷的RSD（n= 7）分別為0.1%、0.7%、1.0%，說(shuō)明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含有量已知的產(chǎn)自重慶龍池鎮(zhèn)的鳳尾草樣品0.5 g，共6份，然后精密吸取對(duì)照品溶液（蕨素C-3-O-葡萄糖苷3.2 mg/mL、忍冬苷6.9 mg/mL和野漆樹(shù)苷17.5 mg/mL）各0.1 mL，加入藥材中，按“1.2.2.2”和“1.2.1”項(xiàng)下方法操作 （用甲醇19.7 mL提?。┖蜏y(cè)定，計(jì)算3種化合物的加樣回收率。結(jié)果，蕨素C-3-O-葡萄糖苷、忍冬苷和野漆樹(shù)苷的加樣回收率分別為99.9%～103.5%（RSD 1.4%）、99.2%～104.1%（RSD 1.8%）、99.5%～103.0%（RSD 1.2%），說(shuō)明該方法的加樣回收率良好，見(jiàn)表2。

2.6 樣品測(cè)定 不同產(chǎn)地樣品按 “1.2.2.2”項(xiàng)下方法操作，在 “1.2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，每個(gè)產(chǎn)地樣品平行測(cè)定3次，取峰面積平均值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests

3 討論

蕨素C-3-O-葡萄糖苷為1-茚酮的糖苷衍生物（結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2），紫外光譜顯示，其有3個(gè)吸收峰，λmax1、λmax2和λmax3分別為 303、258和217.5 nm，ε1、ε2和ε3分別為3.6×103、2.6×104和5.4× 104L/（mol/cm），而且野漆樹(shù)苷和忍冬苷在350 nm處均有吸收峰。綜合靈敏度和干擾方面，本實(shí)驗(yàn)選擇在258 nm波長(zhǎng)下測(cè)定蕨素C-3-O-葡萄糖苷，而在350 nm波長(zhǎng)下測(cè)定野漆樹(shù)苷和忍冬苷。根據(jù)表3可知，不同產(chǎn)地鳳尾草中野漆樹(shù)苷和忍冬苷的含有量較高，而蕨素C-3-O-葡萄糖苷的含有量相對(duì)較低。此外，各產(chǎn)地鳳尾草中蕨素C-3-O-葡萄糖苷的含有量在0.09～1.35 mg/g之間，其中重慶巫溪和龍池鎮(zhèn)樣品中的含有量較高，而北碚樣品中未測(cè)得該成分；忍冬苷的含有量在0.95～7.56 mg/g之間，其中重慶開(kāi)縣樣品中的含有量較高；野漆樹(shù)苷的含有量在0.22～5.48 mg/g之間，其中重慶開(kāi)縣、巫溪和萬(wàn)州樣品中的含有量較高。綜上所述，不同產(chǎn)地鳳尾草中3種有效成分的含有量差異較大，其中蕨素C-3-O-葡萄糖苷最高與最低含有量相差約15倍，忍冬苷含有量相差約8倍，而野漆樹(shù)苷含有量相差達(dá)25倍，提示鳳尾草藥材質(zhì)量與產(chǎn)地關(guān)系較大。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果Tab.3 Content determ ination of sam p les from different grow ing areas(mg/g,n=3)

圖2 蕨素C-3-0-葡萄糖苷結(jié)構(gòu)Fig.2 Structrue of p terosin C 3-0-β-D-glucosidede

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Sim ultaneous determ ination of three constituents in Pterismultifida from different grow ing areas by HPLC

LIU Jian-qun1， LIU Jian1， JIANGWei2， ZHONG Guo-yue2*
（1.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine；Key Laboratory of Modern Preparation of Traditional Chinese Medicine，Ministry of Fducation，Nanchang 330004，China；2.JiangxiUniversity of TraditionalChineseMedicine；TheChineseMedicineResourceand NationalMedicine Research Center，Nanchang 330004，China）

AIMTo establish an HPLCmethod for simultaneously determining three constituents（pterosin C 3-O-β-D-glucosidede，lonicerin and rhoifolin）in Pterismultifida from different growing areas.METHODSThe P.multifida methanol extractwas carried out on a Diamonsil C18Column（4.6 mm×250 mm，5μm），themobile phase was acetonitrile-water（containing 0.15%formic acid）in a gradient elution manner，the flow rate was 1.0 mL/min at30℃，and the detection wavelength was setat258 nm and 350 nm，respectively.RESULTSExcellent chromatographic separation was achieved with good linearity（r＞0.999）within the studied concerntration ranges.The recovery ranges for pterosin C 3-O-β-D-glucosidede，lonicerin and rhoifolin were 101.0%（RSD 1.4%），101.0%（RSD 1.8%），and 101.6%（RSD 1.2%），respectively.The difference of pterosin C 3-O-β-D-glucosidede content in P.multifida collected from 10 growing areas between maximum and minimum value reached 15 times，of lonicerin about 8 times，and of rhoifolin as high as25 times.CONCLUSIONThemethod can simultaneously determine the 3 constituents in P.multifida，and the growing areas of this plant are closely linked to its quality.

HPLC；Pterismultifida；pterosin C 3-O-β-D-glucosidede；lonicerin；rhoifolin

R284.1

：A

：1001-1528（2015）07-1518-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.026

2014-10-09

中藥國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高暨2015版藥典科研項(xiàng)目；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 （30960495）

劉建群 （1970—），男，博士，教授，從事中藥活性成分及質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。Tel：（0791）87119027，E-mail：liu5308@ sina.com

*通信作者：鐘國(guó)躍 （1958—），男，博士，研究員，從事中藥資源、質(zhì)量評(píng)價(jià)與民族藥研究。E-mail：zgy1037@163.com