王新雨， 鄭曉媚， 譚曉梅

（南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院廣東省中藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510515）

HPLC-ELSD法同時(shí)測(cè)定九香蟲中的亞油酸、油酸及軟脂酸

王新雨， 鄭曉媚， 譚曉梅*

（南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院廣東省中藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510515）

目的建立一種同時(shí)定量測(cè)定九香蟲中未甲酯化的亞油酸、油酸及軟脂酸方法。方法九香蟲石油醚提取物以

高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（HPLC-ELSD）分析，采用Prevail C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），乙腈-甲

醇 （95∶5）為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，洗脫時(shí)間為15 min。結(jié)果亞油酸、油酸及軟脂酸峰面積的自然對(duì)數(shù)與相應(yīng)質(zhì)量濃

度的自然對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系。其中，亞油酸的線性方程為Y=1.211 7X-2.965 6，r=0.999 0，線性范圍為

0.135 ～0.450 mg/mL，平均加樣回收率為98.1%，RSD為2.5%；油酸的線性方程為Y=1.149 2X-2.757 0，r= 0.999 0，線性范圍為0.268～0.893 mg/mL，平均加樣回收率為99.6%，RSD為2.3%；軟脂酸的線性方程為Y= 1.104 7X-2.327 6，r=0.999 1，線性范圍為0.150～0.500mg/mL，平均加樣回收率為100.1%，RSD為2.8%。結(jié)論該方法中的樣品不需要甲酯化，而且測(cè)定快速、簡便、準(zhǔn)確，可作為九香蟲飲片的質(zhì)量控制方法。

HPLC-ELSD；九香蟲；亞油酸；油酸；軟脂酸

九香蟲為蝽科昆蟲九香蟲（stink-bug，Aspon- gopus chinensis Dallas）的干燥體，具有理氣止痛，溫中助陽的功效，可用于治療胃寒脹痛、肝胃氣痛、腎虛陽痿、腰膝酸痛［1］。一般認(rèn)為，九香蟲以含油性成分量大者為佳，而粗脂肪占其干質(zhì)量的53.0%［2］，其中含有油酸、亞油酸及軟脂酸等脂肪酸。研究表明［3］，脂肪酸對(duì)人體具有平衡調(diào)節(jié)作用，在降血脂、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等方面起著重要的作用。

目前，對(duì)于亞油酸、油酸及軟脂酸的測(cè)定多采用GC法［4］、GC-MS法［5-6］、柱前皂化或衍生化HPLC法［7-9］、HPLC-ELSD法［10-12］。但GC與GCMS法由于柱溫過高，在分析中容易引起亞油酸雙鍵斷裂或異構(gòu)化［13］，并且GC-MS法在質(zhì)量控制中難以推廣；柱前衍生化HPLC法通常是先用石油醚將脂肪酸提出，然后取一定量油脂皂化或衍生化進(jìn)行測(cè)定，操作步驟繁瑣，容易造成誤差［14-15］；高效液相-蒸發(fā)光散射（HPLC-ELSD）法測(cè)定脂肪酸時(shí)，樣品不需要甲酯化，操作簡單方便。因此，本實(shí)驗(yàn)建立HPLC-ELSD法來測(cè)定九香蟲中的亞油酸、油酸及軟脂酸，為其質(zhì)量控制和品種評(píng)價(jià)提供方法。

1 儀器與材料

Agilent1100高效液相色譜儀（美國Agilent Technologies公司）；Alltech 2000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 （美國Alltech公司）。石油醚 （60～90℃）、乙醚、冰醋酸均為分析純 （國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇、乙腈均為色譜純 （德國Merck公司）。亞油酸、油酸、軟脂酸 （批號(hào)分別為111622-201203、 111621-201004、 190029-201202，中國食品藥品檢定研究院）。

九香蟲飲片 （安徽廣印堂中藥股份有限公司，批號(hào)分別為130801、130901，產(chǎn)地貴州；廣州市藥材公司中藥飲片廠，批號(hào)YPA3G0001，產(chǎn)地貴州；廣州至信中藥飲片有限公司，批號(hào)130901，產(chǎn)地貴州；康美藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)130813321，產(chǎn)地四川），經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)中藥鑒定教研室劉傳明副教授鑒定為蝽科昆蟲九香蟲Aspongopus chinensis Dallas的干燥體。

2 方法

2.1 色譜條件 Prevail C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈-甲醇 （95∶5），等度洗脫；體積流量0.8 mL/min；漂移管溫度50℃；載氣為N2；體積流量1.2 L/min；柱溫35℃；進(jìn)樣10μL。色譜圖見圖1。

2.2 溶液的制備

圖1 樣品溶液(A)、對(duì)照品溶液 (B)和空白溶液(C)的HPLC-ELSD色譜圖Fig.1 HPLC-ELSD chromatograms of blank solution(A) reference substances(B)and stink-bug sam p le (C)

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取亞油酸45 mg、油酸89 mg、軟脂酸90 mg，分別置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度。然后，取上述溶液各1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即得含亞油酸0.45 mg/m L、油酸0.89 mg/mL、軟脂酸0.50 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取樣品粗粉0.25 g，置于具塞試管中，加入石油醚5 mL，超聲20 min，取上清液，重復(fù)3次后合并，減壓濃縮至無明顯醚味，加少許甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 理論塔板數(shù) 精密吸取供試品溶液適量，進(jìn)樣10μL，以供試品主成分峰的保留時(shí)間 （tR）和半高峰寬 （W/h/2）計(jì)算色譜柱的理論塔板數(shù)（n），計(jì)算公式為n=5.54［tR/（W/h/2）］2。結(jié)果，測(cè)得亞油酸、油酸、軟脂酸理論塔板數(shù)分別為9 536、12 527、8 872，分離度均大于1.5。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液適量，進(jìn)樣10μL，連續(xù)6次，計(jì)算亞油酸、油酸及軟脂酸峰面積。結(jié)果，測(cè)得三者 RSD分別為1.7%、1.3%、1.6%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液適量，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣10μL，計(jì)算亞油酸、油酸及軟脂酸峰面積。結(jié)果，測(cè)得三者RSD分別為1.5%、1.3%、1.8%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液3、4、5、8、9 mL，分別置于10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，制備每1 mL含亞油酸分別為0.14、0.18、0.23、0.36、0.40 mg，含油酸分別為0.27、0.36、0.45、0.70、0.80 mg，含軟脂酸分別為0.15、0.20、0.25、0.40、0.45 mg的溶液，均進(jìn)樣10μL。然后，分別以亞油酸、油酸及軟脂酸質(zhì)量濃度的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，峰面積的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。由表可知，三者在濃度范圍內(nèi)，峰面積自然對(duì)數(shù)與其質(zhì)量濃度自然對(duì)數(shù)均呈良好線性關(guān)系。

表1 亞油酸、油酸和軟脂酸的線性方程Tab.1 Linear equation of linoleic acid,oleinic acid and palm itic acid

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 按照 “2.2.2”項(xiàng)下方法，平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣10μL，再采用外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算亞油酸、油酸及軟脂酸的含有量。結(jié)果，測(cè)得三者RSD分別為1.8%、1.7%和1.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，平行制備6份。精密稱取九香蟲0.125 g，置于試管中，分別加入亞油酸1.45 mg、油酸3.15 mg、軟脂酸1.60 mg，再加入石油醚5 mL，超聲20 min，取上清液，重復(fù)3次后合并，減壓濃縮至無明顯醚味，少許甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。然后，進(jìn)樣10μL，外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算三者的含有量和加樣回收率，計(jì)算公式為加樣回收率%=［測(cè)得量（mg）-樣品中含量（mg）］/對(duì)照品加入量×100%，結(jié)果見表2、表3和表4。由表可知，三者的平均加樣回收率分別為98.1%、99.6%及100.1%，RSD分別為2.5%、2.3%及2.8%，表明該方法回收率良好。

表2 亞油酸加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.2 Results of recovery tests for linoleic acid(n=6)

表3 油酸加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.3 Results of recovery tests for oleinic acid(n=6)

表4 軟脂酸加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.4 Results of recovery tests for palm itic(n=6)

2.4 樣品測(cè)定 取九香蟲粗粉5批，分別精密稱取0.25 g，按照 “2.2.2”項(xiàng)下方法操作，外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算樣品中亞油酸、油酸及軟脂酸的含有量，結(jié)果見表5。

表5 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.5 Determ ination resu lts of sam p les(n=3)

3 結(jié)果與討論

由表5可知，5批樣品中亞油酸、油酸、軟脂酸的含有量差別較大。在本實(shí)驗(yàn)所用的飲片中，批號(hào)130813321者為清水炮制，而且其中這3種成分的含有量均高于其他4批鹽水炮制的飲片。因此，不同炮制方法是否會(huì)影響其有效成分的含有量尚有待于后期進(jìn)一步研究。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相乙腈會(huì)影響分離效果，當(dāng)乙腈-甲醇的比例為95∶5時(shí)，亞油酸與油酸的分離度大于1.5，且峰形較好。另外，當(dāng)流動(dòng)相的體積流量過高時(shí)，基線不平穩(wěn)，而在0.8 m L/min時(shí)，基線平穩(wěn)。而且，漂移管溫度和氮?dú)怏w積流量偏低也能影響基線穩(wěn)定性，當(dāng)溫度為50℃，體積流量為1.2 L/min時(shí)，基線平穩(wěn)。樣品前處理采用正交試驗(yàn)，從提取時(shí)間、提取次數(shù)以及石油醚加入量的角度進(jìn)行考查，發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入石油醚2 m L、超聲20min、提取3次時(shí)，亞油酸、油酸及軟脂酸的提取效果最好。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-ELSD法測(cè)定九香蟲中的亞油酸、油酸及軟脂酸含有量，不需要甲酯化即可直接分析，避免了甲酯化產(chǎn)物的多樣性、甲酯化不徹底等問題，而且操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。因此，該方法可作為九香蟲藥材的質(zhì)量控制方法，也可為其他藥材中的這3種成分含有量分析提供參考。

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：10.

［2］涂愛國，劉宇文，殷紅妹.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析九香蟲脂肪油的化學(xué)成分［J］.江西中醫(yī)藥，2012，43（11）：66-67.

［3］陳銀基，鞠興榮，周光宏.飽和脂肪酸分類與生理功能［J］.中國油脂，2008，33（3）：35-39.

［4］肖會(huì)敏，何 悅，楊 倩，等.GC法測(cè)定椒目仁油中油酸、亞油酸及α-亞麻酸［J］.中成藥，2011，33（8）：1361-1364.

［5］王 加，王 淼，翁 琰，等.GC-MS法分析川烏炮制前后揮發(fā)性成分［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，31（8）：622-628.

［6］蘭 梅，王 平，王志英，等.巴豆油化學(xué)成分的GC-MS分析［J］.中藥材，2012，35（7）：1105-1108.

［7］羅淑文，鄧遠(yuǎn)輝，朱艷紅.柱前衍生化HPLC法測(cè)定鴉膽子油中油酸和亞油酸的含量［J］.中藥新藥與臨床藥理，2011，22（3）：328-330.

［8］劉 威，張 帥，付小環(huán)，等.柱前皂化HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地桃仁中亞油酸和油酸的量［J］.中草藥，2013，43（14）：2000-2003.

［9］王 遠(yuǎn)，郭 萍，李 暉，等.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定紫蘇子中α-亞麻酸和亞油酸的含量［J］.藥物分析雜志，2012，32（2）：252-254.

［10］張 銳，王 玉，石蓓佳，等.HPLC-ELSD測(cè)定聚山梨酯80中聚醚組成及油酸含量［J］.藥物分析雜志，2013，33（6）：994-998.

［11］謝元?jiǎng)?，何厚洪，盛衛(wèi)國，等.HPLC-ELSD測(cè)定油菜蜂花粉中6種脂肪酸［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2014，31（5）：559-563.

［12］劉慧靈，馬國需，孫忠浩，等.反相高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定不同產(chǎn)地蕤仁藥材中亞油酸的含量［J］.中國藥學(xué)雜志，2014，49（15）：1355-1357.

［13］裴 瑾，顏永剛，萬德光.桃仁中脂肪酸的含量分析研究［J］.中藥材，2009，32（6）：908-910.

［14］侯冬巖，回瑞華，李鐵純，等.萊菔子中脂肪酸及主成分γ-亞麻酸的分析［J］.質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2011，32（2）：108-111.

［15］秦建平，陸艷芹，羅雪磊，等.HPLC同時(shí)測(cè)定火麻仁中α-亞麻酸、亞油酸和油酸含量［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（7）：71-73.

Simultaneous determ ination of linoleic acid，oleinic acid and palm itic acid in stink-bug by HPLC-ELSD

WANG Xin-yu， ZHENG Xiao-mei， TAN Xiao-mei*
（School of Traditional Chinese Medicine，Southern Medical University；Guangdong Provincal Key Laboratory of Chinese Materia Medica Preparation，Guangzhou 510515，China）

AIMTo establish a method for simultaneous determination of linoleic acid，oleinic acid and palmitic acid content without methyl esterification in stink-bug（Aspongopus chinensis Dallas）.M ETHODSThe high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detection（HPLC-ELSD）method of stink-bug petroleum ether extractwas applied to Prevail C18Column（250 mm×4.6mm，5μm）with acetonitrile andmethanol asmobile phase，and the elution time was15 min.RESULTSThe linear response was calculated by natural logarithm，the linear range of linoleic acid was 0.135～0.450 mg/mL with the regression equation of Y= 1.211 7X-2.965 6，r=0.999 0；the linear range of oleinic acid was 0.268～0.893 mg/mL with the regression equation Y=1.149 2X-2.757 0，r=0.999 0；the linear range of palmitic acid was 0.150～0.500 mg/mL with the regression equation Y=1.104 7X-2.327 6，r=0.999 1.Their average recoverieswere 98.1%，99.6%and 100.1%，and their RSDs were 2.5%，2.3%and 2.8%，respectively.CONCLUSIONThe sample does not need methyl esterification by thismethod，having the advantages of easy operation，accuracy and fast，so it can be used as a quality controlmethod for stink-bug.

HPLC-ELSD；stink-bug（Aspongopus chinensis Dallas）；linoleic acid；oleinic acid；palmitic acid

R284.1

：A

：1001-1528（2015）07-1522-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.027

2014-10-30

王新雨 （1986—），女，博士，研究方向?yàn)橹兴幹苿el：13246857938，E-mail：379319742@qq.com

*通信作者：譚曉梅 （1963—），女，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿?。Tel：（020）61648265，E-mail：13710730705@163.com