宋書中， 伍春蓮，2*

（1.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西南野生動植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川南充637009；2.西南大學(xué)，三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境與生物資源省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400715）

雷公藤紅素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究進(jìn)展

宋書中1， 伍春蓮1，2*

（1.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西南野生動植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川南充637009；2.西南大學(xué)，三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境與生物資源省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400715）

雷公藤紅素 （celastrol）是一種從傳統(tǒng)中藥雷公藤根皮中提取出的三萜單體，具有顯著的抗癌活性。它作為一種蛋白酶體抑制劑，能影響腫瘤細(xì)胞內(nèi)多種信號通路，如抑制蛋白酶體、IKKα/β激酶、HSP90等，并能激活caspase3/7。本文就雷公藤紅素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及其機(jī)制做一系統(tǒng)綜述。

雷公藤紅素；蛋白酶體；NF-κB；HSP90；凋亡

雷公藤Tripterygium wilfordii Hook.F.，又名黃藤，是我國傳統(tǒng)中草藥，在治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肺結(jié)核以及其他慢性疾病時發(fā)揮著重要作用。雷公藤紅素（celastrol，CSL）是從雷公藤根皮中提取出的一種三萜單體，具有抗炎、治療神經(jīng)性退化疾病等多種藥理活性［1-3］。近年來，它的抗腫瘤作用也備受關(guān)注，其分子機(jī)制較為復(fù)雜，不過越來越多的實(shí)驗(yàn)表明，雷公藤紅素在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面表現(xiàn)出巨大的潛力。

1 雷公藤紅素的理化性質(zhì)

雷公藤紅素又名南蛇藤素或南蛇藤醇，分子式C29H38O4，紅色針狀結(jié)晶，mp 185～200℃，在425 nm處有最強(qiáng)吸收，易溶有機(jī)溶劑，不溶于水。從結(jié)構(gòu)上看，它屬于五環(huán)三萜類化合物，其芳香酮基上的C2和C6有很強(qiáng)的親核活性，從而具有抗腫瘤、抗微生物、抗氧化、細(xì)胞毒性和抗瘧疾等作用，結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 雷公藤紅素化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2 雷公藤紅素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

近年來的實(shí)驗(yàn)表明，低劑量下的雷公藤紅素在多種腫瘤細(xì)胞凋亡體外實(shí)驗(yàn)中都表現(xiàn)出較理想的抑制效果，如乳腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞等［4-9］。雷公藤紅素作為一種天然的蛋白酶體抑制劑［10-11］，可影響細(xì)胞內(nèi)多種信號通路及蛋白發(fā)揮作用，如NF-κB、Hsp90、蛋白酶體、c-Jun、AKT/mTOR、VEGFR、caspase等［1，4，11-12］。

2.1 作用于β1亞基，抑制蛋白酶體活性 蛋白酶體又稱26S蛋白酶體 （沉降系數(shù)為26S），是一種催化復(fù)合蛋白體，可降解細(xì)胞內(nèi)約80%以上的蛋白質(zhì)，如周期蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、IκB-α、促凋亡蛋白Bax以及錯誤折疊蛋白等。蛋白酶體與細(xì)胞中多種信號通路及蛋白發(fā)揮作用密切相關(guān)，例如NF-κB、Bcl-2家族蛋白等［13-14］。

雷公藤紅素作為一種天然蛋白酶體抑制劑，可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡。Yang等［8］用雷公藤紅素 （1～5 mol/L）處理前列腺癌細(xì)胞（PC-3和LNCaP），結(jié)果發(fā)現(xiàn)類胰凝乳蛋白酶的活性明顯受到抑制，泛素化的蛋白及蛋白酶體底物 （IκB-α、Bax、p27）大量堆積，由此開始了對雷公藤紅素作為蛋白酶體抑制劑的研究。隨后其抑制蛋白酶體進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡這一作用被Wang等［15］在人宮頸癌細(xì)胞Hela中得到確認(rèn)，但是它是否直接作用于蛋白酶體仍不明確。Feng等［16］發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素在體外能分別抑制肽基谷氨酰肽水解酶樣（peptidyl glutamyl-like）、胰蛋白酶樣（trypsin-like）、糜蛋白酶樣（chymotrypsin-like）這3類蛋白酶的活性，分別對應(yīng)β1、β2、β5亞基的催化。但是在以上3種催化亞基中，只有β1的活性可被雷公藤紅素抑制，即使在較低的0.2μmol/L濃度下也同樣如此。然后，他們將人的蛋白酶體β1亞基在大腸桿菌中克隆表達(dá)，發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素能明顯地抑制其活性，進(jìn)一步證實(shí)了它是直接抑制蛋白酶體的活性。

蛋白酶體抑制劑可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡［17］。硼替佐米 （bortezomib）作為唯一一種上市的蛋白酶體抑制劑，能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制蛋白酶體降解蛋白，并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡［18］。實(shí)驗(yàn)證明，在多種腫瘤細(xì)胞中，雷公藤紅素也可通過抑制蛋白酶體活性，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和未折疊蛋白反應(yīng)［17-20］。Wang等［15］通過Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素可明顯上調(diào)HeLa細(xì)胞內(nèi)PERK的表達(dá)，同時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的其他標(biāo)志物Bip和IREI也得到上調(diào)。Feng等［16］也證實(shí)，它能激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路的標(biāo)志物eIF2α和CHOP。另外，F(xiàn)ribley等［21］報(bào)道，雷公藤紅素還能激活腫瘤細(xì)胞eIF2α激酶的活性。

2.2 抑制IκB蛋白降解，抑制NF-κB通路活化 NF-κB（nuclear factor kappa B）即核因子κB，是由Rel蛋白家族中的成員以同源或異源二聚體形式形成的一組轉(zhuǎn)錄因子，參與炎癥、免疫、應(yīng)激、細(xì)胞的增殖和細(xì)胞凋亡等多種生理病理過程的基因調(diào)節(jié)。大量實(shí)驗(yàn)表明，持續(xù)性激活NF-κB可以引發(fā)人體中大量的惡性腫瘤［22］。

硼替佐米是一種蛋白酶體抑制劑，能抑制NF-κB通路的活化［23］，而且雷公藤紅素也有同樣的抑制作用［24］。NF-κB通路的激發(fā)需要IκB蛋白的降解，而其前提是IκB激酶（IKK）的活化。2006年，Lee等［4］報(bào)道雷公藤紅素能夠抑制IKKα和IKKβ激酶的活化。Dai等［10］發(fā)現(xiàn)，在雄性激素非依賴型前列腺癌（AIPC）中，它可迅速抑制胞漿中IκBα的降解，阻止RelA進(jìn)入細(xì)胞核。Sethi等［24］報(bào)道，雷公藤紅素能夠抑制誘導(dǎo)型和構(gòu)成型的NF-κB活化，以及腫瘤壞死因子（TNF-α）誘導(dǎo)IκBα激酶的活化及降解。TAK1在TNF激活I(lǐng)KK過程中發(fā)揮著重要作用，而雷公藤紅素能夠抑制TAK1，F(xiàn)reuddsperger等［25］也進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。

TMPRSS2/ERG（T/E）基因能促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲［26］，而NF-κB在此過程中發(fā)揮重要作用。Wang等［27］研究表明，NF-κB能通過 p65第 536位絲氨酸（p536）的磷酸化來激活腫瘤細(xì)胞T/E的表達(dá)。Shao等［28］報(bào)道，雷公藤紅素是 p536的抑制劑，在前列腺癌細(xì)胞（PCa）中通過NF-κB抑制T/E基因的表達(dá)。

2.3 作用HSP90 C-末端，抑制HSR活化 熱休克反應(yīng)（heat shock response，HSR）在促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊過程中起著關(guān)鍵作用，而在多種腫瘤細(xì)胞中，這條通路是持續(xù)和激活過度的［29］。研究顯示，雷公藤紅素能在人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和BT474、人非小細(xì)胞性肺癌細(xì)胞系H157、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y及HeLa細(xì)胞中抑制熱休克反應(yīng)［30］。

人類胞漿中含有兩種HSP90亞型，分別為HSP90α和HSP90β。雷公藤紅素能夠作用于HSP90-Cdc37復(fù)合物［6］，抑制HSP90 ATP酶活性［31］，Cdc-37和ATP結(jié)合域位于HSP90 N-末端。Zhang等［32］認(rèn)為，雷公藤紅素可作用于HSP90 C-末端，進(jìn)而影響HSP90與Cdc37的相互作用。Zamphorlin等［33］通過HSP90α缺失變異體C-HSP90α（只剩C-末端）的SEC-MALS實(shí)驗(yàn)，證實(shí)雷公藤紅素是作用于C-末端結(jié)合域從而影響HSP90α的功能。Sreeramulu等［34］報(bào)道，它不僅能直接作用于HSP90復(fù)合物，而且會將Cdc37作為靶標(biāo)，從而影響HSP90-Cdc37復(fù)合物的形成。Peng等［31］認(rèn)為，雷公藤紅素可能是以共價(jià)鍵的方式與Cdc37氨基端的3個半胱氨酸殘基相連，進(jìn)而影響蛋白激酶的相互作用。此外，它不僅能誘導(dǎo)HSP90分子伴侶 p23的寡聚化［35］，而且還是熱休克轉(zhuǎn)錄因子 （HSF1）的抑制劑［34］。

HSP90維持著細(xì)胞內(nèi)多種激酶、轉(zhuǎn)錄因子、受體等的穩(wěn)定性和活性，如Raf-1、EGFR和AKT［36-38］。雷公藤紅素不僅能促進(jìn)H1650和H1975細(xì)胞內(nèi)EGFR及AKT的降解［39］，同時還可促進(jìn)H460細(xì)胞EGFR、ErbB2和凋亡抑制蛋白survivin降解，并提高細(xì)胞內(nèi)p53蛋白表達(dá)水平［40］。Huang等［41］發(fā)現(xiàn)，無論在常氧或缺氧條件下，雷公藤紅素都能夠下調(diào)HIF-1αmRNA水平，降低核HIF-1α蛋白累積。

2.4 升高Caspase-3/7表達(dá)水平 Caspase凋亡途徑是細(xì)胞凋亡不可或缺的通路。其中，Caspase-3/7被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者［42］，一旦被激活就會導(dǎo)致級聯(lián)的介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。PARP（poly ADP-ribose polymerase）為DNA修復(fù)酶，同時也是Caspase的切割底物［43］，常被看作是細(xì)胞凋亡的標(biāo)記物。

實(shí)驗(yàn)顯示，雷公藤紅素能夠明顯提高多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)Caspase3/7蛋白表達(dá)水平［39，44-45］，同時PARP的剪切帶也得到不同程度的增強(qiáng)［39，46-47］。Fan等［39］通過Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在雷公藤濃度為2μmol/L和4μmol/L時，H1650細(xì)胞Caspase3/7蛋白濃度明顯升高，PARP也得以激活。Jiang等［44］報(bào)道，雷公藤紅素聯(lián)合肝細(xì)胞生長因子受體（C-Met）抑制劑PHA-665752（PHA）作用于Huh7細(xì)胞，在高濃度（大于1.0μmol/L）時，它能使細(xì)胞停滯在G2/M時期并激活Caspase-3/7。另外，Mou等［48］發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中，雷公藤紅素可以促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放，上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，同時下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)。Yang等［45］報(bào)道，它可劑量依賴性地誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，在MCF-7細(xì)胞中，雷公藤紅素顯著促進(jìn)了細(xì)胞色素C及凋亡誘導(dǎo)因子AIF釋放，并降低Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax蛋白表達(dá)。

2.5 其他轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 在細(xì)胞有條不紊地生命代謝的穩(wěn)態(tài)中，稍微出現(xiàn)一個或幾個小環(huán)節(jié)的細(xì)小差錯，就會誘發(fā)整個細(xì)胞代謝的紊亂，可能將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的發(fā)生。

馬永嵐等［49］報(bào)道，在人早幼粒白血病細(xì)胞HL-60中，雷公藤紅素能抑制Akt的磷酸化，同時下調(diào)CyclinD1蛋白的表達(dá)水平，并呈顯著的劑量和時間依賴性來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。周培等［50］報(bào)道，它能顯著抑制PCa細(xì)胞株生長，同時降低SENP1基因在mRNA水平表達(dá)，表明雷公藤紅素可能是通過SENP1相關(guān)信號通路來誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡的。雌激素受體α（ERα）作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，是治療乳腺癌的靶點(diǎn)。Jang等［51］發(fā)現(xiàn)，在人乳腺癌細(xì)胞 MCF7和T47D中，雷公藤紅素能降低ERα在mRNA及蛋白水平表達(dá)，揭示它可降低MCF7和T47D細(xì)胞中ERα的轉(zhuǎn)錄活性，對于治療人乳腺癌有著重大的意義。

3 雷公藤紅素的藥物作用強(qiáng)度

作為從傳統(tǒng)中草藥中提取出的單體，雷公藤紅素的抗炎、治療神經(jīng)退行性疾病及抗癌作用已被廣泛報(bào)道。作為一種具有巨大潛在價(jià)值的抗腫瘤新藥，它無論是在腫瘤細(xì)胞，還是在腫瘤組織模型方面都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制腫瘤增殖的特性，并具劑量和時間依賴性。

雷公藤紅素針對不同類型的體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，其半數(shù)抑制濃度 （IC50）也不同，見表1。Feng等［16］用雷公藤紅素處理Hela細(xì)胞48 h，MTT細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)檢測出其IC50值為（0.79±0.22）μmol/L。

利用腫瘤異體移植模型（Tumor xenograftmodel），Pang等［54］以雷公藤紅素2 mg/（kg·d）的量連續(xù)腹腔注射16 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)裸鼠PC-3腫瘤組織體積明顯減小，從 （129.36± 37.35）mm3降至 （35.49±9.71）mm3，而對照組腫瘤組織則明顯增大，從 （130.63±37.62）mm3升至 （330.74± 72.20）mm3。采用同樣的腫瘤異體移植模型，Zheng等［55］以雷公藤紅素每2天注射一次裸鼠腹腔，連續(xù)21 d，發(fā)現(xiàn)隨著濃度的增大，它能明顯的抑制肺癌細(xì)胞95-D組織體積的增大，見表2。

在臨床實(shí)驗(yàn)中，Zhang等［56］報(bào)道，按100μg/kg的劑量，通過靜脈注射，雷公藤紅素峰濃度Cmax為 （38.83± 12.83）μg/L，血藥濃度為 （79.35±19.85）μg/（h·L），半衰期T1/2β為 （8.33±0.84）h，而片劑的生物利用度為17.06%。由此推測，體內(nèi)代謝和組織分布可能是生物利用度較低的原因。

表1 雷公藤紅素作用不同類型細(xì)胞系IC50值

表2 雷公藤紅素作用人肺癌95-D細(xì)胞裸鼠模型

4 展望

雷公藤作為一種常用藥材，在消炎止痛、祛風(fēng)通絡(luò)、殺蟲解毒方面發(fā)揮著重要作用。而來源于其根皮的三萜單體雷公藤紅素，近年來在抗腫瘤、抗炎等方面也顯示出巨大的潛在治療價(jià)值。另外在低濃度下，雷公藤紅素不易產(chǎn)生毒副作用，而其在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面的顯著活性正在不斷得到實(shí)驗(yàn)的證實(shí)。

作為一種蛋白酶體抑制劑，雷公藤紅素可作用于蛋白酶體β1亞基，從而抑制其活性。它可通過抑制IκB蛋白降解，從而抑制NF-κB信號途徑活化。而且，雷公藤紅素還能通過作用于HSP90 C-末端結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而影響HSP90與其底物蛋白的相互作用。本課題組認(rèn)為，雷公藤紅素分別通過直接作用于蛋白酶體和HSP90，引起蛋白酶體多種底物蛋白降解異常，以及HSP90多種分子伴侶功能異常。受到抑制的蛋白酶體，通過抑制IκB蛋白的降解，進(jìn)而抑制NF-κB信號通路的活化，使錯誤折疊蛋白累積，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，再通過激活線粒體凋亡信號途徑，進(jìn)一步誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。作為一種提取于我國傳統(tǒng)中草藥的抗腫瘤藥物，雷公藤紅素高效低毒，其藥用價(jià)值正在被不斷地發(fā)掘，期望能像青蒿素一樣為人類的醫(yī)藥事業(yè)做出更大的貢獻(xiàn)。

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R966

：A

：1001-1528（2015）07-1548-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.033

2014-11-12

中國博士后基金項(xiàng)目 （2013M540391）；四川省教育廳重大培育項(xiàng)目 （13CZ0029）；三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境與生物資源省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題基金項(xiàng)目（SKL-2011-05）

宋書中 （1988—），男，碩士，從事天然藥物對腫瘤細(xì)胞凋亡作用的研究。

*通信作者：伍春蓮 （1976—），女，博士，副教授，從事細(xì)胞和分子生物學(xué)的研究和教學(xué)。Tel：18990874796，E-mail：wcl_xj@ 163.com