王 萍， 李 茜， 周 穎， 楊 芳

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆烏魯木齊830000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊830011）

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化苓柏解毒丸的提取工藝

王 萍1， 李 茜1， 周 穎2， 楊 芳2

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆烏魯木齊830000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊830011）

目的采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化苓柏解毒丸的提取工藝。方法以溶媒用量、提取時(shí)間為自變量，以鹽酸小檗堿的含有量、總多糖的含有量及浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)自變量各水平進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，用效應(yīng)面法選擇最佳工藝條件，并進(jìn)行預(yù)測分析。結(jié)果確定最優(yōu)提取工藝為提取2次，加14倍量的水，每次提取60min。結(jié)論利用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化苓柏解毒丸的提取工藝，方法簡便，預(yù)測性良好。

苓柏解毒丸；星點(diǎn)設(shè)計(jì)；效應(yīng)面優(yōu)化法；提取工藝

星點(diǎn)設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）又稱中心組合設(shè)計(jì)，是一種多因素五水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。它是在二水平析因設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上加極值點(diǎn)、中心點(diǎn)組成的。因此星點(diǎn)設(shè)計(jì)與正交、均勻設(shè)計(jì)相比具有較高的實(shí)驗(yàn)精度，并且充分考慮了各因素之間的交互作用，但試驗(yàn)次數(shù)增加不多；星點(diǎn)設(shè)計(jì)所建立的回歸模型比后面兩種方法更適宜多元非線性模型的擬合，因此能建立擬合度好、相關(guān)性高、預(yù)測性較好的回歸模型；星點(diǎn)設(shè)計(jì)結(jié)合效應(yīng)面優(yōu)化法來分析、優(yōu)化工藝條件更加簡單、直觀。在工藝優(yōu)化和處方篩選過程中，常需同時(shí)考察多個(gè)因素對(duì)結(jié)果的影響，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化。因此，目前星點(diǎn)設(shè)計(jì)結(jié)合效應(yīng)面優(yōu)化法在中藥制劑工藝優(yōu)化和處方篩選方面的應(yīng)用也越來越多［1-3］。

苓柏解毒丸是根據(jù)我院皮膚科專家多年臨床實(shí)踐的經(jīng)驗(yàn)方開發(fā)而成的中藥制劑，主要用于治療脾虛濕盛所致尋常型銀屑病、慢性濕疹等疾病，臨床療效較好。處方由土茯苓、黃柏、茯苓和薏苡仁等藥材組成。本研究根據(jù)處方中各味藥材有效成分的理化性質(zhì)及藥理作用，設(shè)計(jì)將復(fù)方中部分藥材加水提取。因此采用單因素試驗(yàn)和星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法結(jié)合的方法，以鹽酸小檗堿和總多糖的含有量及浸膏得率作為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選了苓柏解毒丸的水提取工藝，為其進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供了科學(xué)、合理的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥材 土茯苓、黃柏、茯苓和薏苡仁等藥材由新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部提供，經(jīng)檢驗(yàn)均符合 《中國藥典》2010年版一部各藥材項(xiàng)下的規(guī)定。

1.2 儀器與試藥

1.2.1 儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀（二極管陣列檢測器，美國Waters公司）；AL204型電子天平［梅特勒-托利多儀器 （上海）有限公司，0.1 mg］；AG135型電子天平 ［梅特勒-托利多儀器 （上海）有限公司，0.01 mg］；Cintra-20型紫外-可見分光光度計(jì)（澳大利亞GBC）；SMART-N型超純水儀 （上?？道追治鰞x器有限公司）。

1.2.2 試藥 鹽酸小檗堿對(duì)照品 （批號(hào)110713-201212，供含量測定用）、D-無水葡萄糖對(duì)照品 （批號(hào)110833-201205，供含量測定用）均由中國食品藥品檢定研究院提供。甲醇、乙腈為色譜純，實(shí)驗(yàn)中所用其余試劑如：磷酸、鹽酸、硫酸、苯酚、乙醇、十二烷基磺酸鈉等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽酸小檗堿的測定［4-7］

2.1.1 色譜條件 SymmetryShieldTMRP18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5.0μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（42∶58）（每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.1 g）；檢測波長265 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量10μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品6.59 mg，加流動(dòng)相制成貯備液 （質(zhì)量濃度為0.131 8 mg/mL）。

2.1.3 供試品溶液的制備 按處方取各藥材，精密稱定，加水浸泡1 h，稱定質(zhì)量，回流提取1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，并用水補(bǔ)足減失的溶劑量，濾過，濾液濃縮至適量，放冷；按3∶2比例加入鹽酸-甲醇溶液 （1∶100），搖勻，稱定質(zhì)量，超聲處理50 min，放冷，再稱定質(zhì)量，并用鹽酸-甲醇溶液 （1∶100）補(bǔ)足減失的質(zhì)量，離心，取上清液，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 陰性對(duì)照樣品溶液的制備 按 “2.1.3”項(xiàng)下方法制備不含黃柏的陰性對(duì)照樣品溶液。

2.1.5 專屬性試驗(yàn) 精密吸取 “2.1.2”、“2.1.3”、“2.1.4”項(xiàng)下溶液各10μL，按 “2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測定。結(jié)果供試品與對(duì)照品在相同時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)同一色譜峰，而陰性對(duì)照無干擾。表明本方法有較好的專屬性。見圖1。

圖1 鹽酸小檗堿高效液相色譜圖

2.1.6 線性關(guān)系考察 分別精密取 “2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液0.5、1、2、3、4 mL，置5 mL量瓶中，加流動(dòng)相制成質(zhì)量濃度為 13.18、26.36、52.72、79.08、105.44 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測定。以峰面積積分值對(duì)質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得到其回歸方程A=37 945C-32 001，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。說明鹽酸小檗堿在13.18～105.44μg/mL范圍內(nèi)與峰面積積分值有良好的線性關(guān)系。

2.1.7 精密度試驗(yàn) 吸取同一對(duì)照品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果其RSD為0.29% （n=6）。表明儀器精密度較好。

吸取同一對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)測定6 d，結(jié)果其日間精密度RSD為0.72% （n=6），精密度較好。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 按處方取同批藥材6份，精密稱定，照 “2.1.3”項(xiàng)下制備樣品溶液，進(jìn)樣測定，結(jié)果其RSD為1.97% （n=6），重復(fù)性較好。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于 0、6、12、24、48 h進(jìn)樣測定，結(jié)果其RSD為1.80% （n=6）。表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.1.10 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量的同批樣品6份，精密稱定，分別精密加入一定量的鹽酸小檗堿對(duì)照品，按“2.1.3”項(xiàng)下制備樣品，進(jìn)樣測定，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2 提取液中總多糖的測定［8-9］

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取葡萄糖對(duì)照品10.9 mg，加水制成對(duì)照品貯備液 （葡萄糖質(zhì)量濃度為0.109 0 mg/mL）。

2.2.2 供試品溶液的制備 按處方取各藥材，精密稱定，加水浸泡1 h，稱定質(zhì)量，回流提取1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，并用水補(bǔ)足減失的溶劑量，濾過，即得。

2.2.3 葡萄糖最大吸收波長的測定 分別精密取葡萄糖貯備液0.4 m L、供試品溶液1 mL，分別置10 m L具塞試管中，分別依次加入1 mL 5%苯酚溶液和5 mL濃硫酸溶液，室溫放置10min，置沸水浴中加熱20 min，取出迅速冷卻至室溫。另外精密取1 m L蒸餾水于10 mL具塞試管中，同法制備得空白對(duì)照溶液。分別在200～800 nm進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果葡萄糖對(duì)照品溶液和供試品溶液均在485 nm處有最大吸收。見圖2。

圖2 葡萄糖對(duì)照品和樣品的紫外-可見光譜圖

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密取 “2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液各0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，同“2.2.3”項(xiàng)下方法操作。以吸光度值 （A）與對(duì)照品的質(zhì)量 （C）進(jìn)行線性回歸，得到其回歸方程為A=0.010 779 8 C-0.024 7，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8。說明葡萄糖質(zhì)量在32.7～76.3μg范圍內(nèi)與吸光度值有較好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密取對(duì)照品貯備液0.4 mL共6份，同 “2.2.3”項(xiàng)下方法操作，結(jié)果所得吸光度值的RSD為1.55% （n=6），精密度較好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密取同一供試品溶液1 mL共6份，同 “2.2.3”項(xiàng)下方法操作，結(jié)果所得吸光度值的RSD為1.26% （n=6），重復(fù)性較好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密取供試品溶液1 m L，同“2.2.3”項(xiàng)下方法操作，但顯色后分別放置30、45、60、85、100、125、150、180、240 min時(shí)，測定吸光度，結(jié)果所得吸光度值的RSD為0.77%，表明供試品溶液顯色后4 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量的同批樣品6份，精密稱定，分別精密加入葡萄糖對(duì)照品，照 “2.2.2”項(xiàng)下制備樣品，同 “2.2.3”項(xiàng)下方法操作，測定吸光度，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.3 提取工藝研究 根據(jù)處方中各味藥材的理化性質(zhì)和藥理作用，確定其中的土茯苓、黃柏等藥材采用水提取。本研究采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法（CCD-RSM）優(yōu)選最佳工藝，并進(jìn)行預(yù)測分析和驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。

因提取次數(shù)為非連續(xù)變量，不能進(jìn)行回歸處理，因此對(duì)提取次數(shù)采用單因素考察的方法，試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 提取次數(shù)的單因素考察

采用鹽酸小檗堿和總多糖的含有量及浸膏得率作為提取工藝的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，其中鹽酸小檗堿含有量的權(quán)重系數(shù)為40，總多糖含有量為40，浸膏得率為20，滿分為100。

2.3.1 浸膏得率測定方法 取已恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿，加入精密吸取的供試液20 mL，水浴蒸干，105℃干燥3 h，干燥器中冷卻30 min后，迅速精密稱定質(zhì)量，計(jì)算浸膏得率。

2.3.2 吸水率的測定 取裝有水的燒杯，加入48.51 g藥材浸泡至透心，用紗布過濾不擠壓，瀝盡水后，稱量充分吸水后的藥物質(zhì)量為105.0 g，吸水率=（105.0-48.51）/ 48.51=1.16。

2.3.3 單因素考察提取次數(shù)對(duì)綜合評(píng)分的影響 按處方取擬采用水提取的各藥材，精密稱定，設(shè)定其提取時(shí)間均為1 h，加水倍量均為8倍，分別提取1、2、3次，考察不同提取次數(shù)對(duì)綜合評(píng)分的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可以看出提取2次與3次的綜合評(píng)分很接近，考慮到生產(chǎn)實(shí)際，確定提取次數(shù)為2次。

2.3.4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝［10-12］

2.3.4.1 方案設(shè)計(jì)及結(jié)果 在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇對(duì)提取試驗(yàn)結(jié)果影響較顯著的兩個(gè)因素：提取時(shí)間和加水倍量（提取次數(shù)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定為2次）。根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)的原理，各因素的極大、極小水平根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，結(jié)合工業(yè)化大生產(chǎn)，從節(jié)約成本的角度考慮。因素水平見表3。

表3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)的因素與水平

按處方取擬采用水提取的各藥材，精密稱定，按表4安排實(shí)驗(yàn)，其中1、2、5、8、12號(hào)5個(gè)試驗(yàn)是重復(fù)試驗(yàn)。分別測定水提液中鹽酸小檗堿含有量、總多糖含有量和浸膏得率，計(jì)算綜合評(píng)分。星點(diǎn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表4。

表4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.3.4.2 模型擬合 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)，采用SAS JMP PRO 10.0.2（64bit）擬合模型，并用統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行回歸分析。

其多元線性回歸方程為：Y=63.682 3+6.154 2X1+ 14.543 8X2（P＜0.076 3，r2=0.282 7）。

其中，Y為綜合評(píng)分，X1為提取時(shí)間，X2為加水倍量。結(jié)果表明：多元線性回歸擬合后復(fù)相關(guān)系數(shù)較低，線性相關(guān)性較差。

二次多項(xiàng)式擬合結(jié)果為：

其中，Y為綜合評(píng)分，X1為提取時(shí)間，X2為加水倍量。結(jié)果表明：二次多項(xiàng)式回歸數(shù)學(xué)模型擬合復(fù)相關(guān)系數(shù)較高，擬合較好。其中加水倍量對(duì)綜合評(píng)分有顯著性影響，而提取時(shí)間沒有顯著性影響。

模型擬合結(jié)果表明，二項(xiàng)式擬合優(yōu)于多元線性回歸方程。以上述數(shù)學(xué)模型為基礎(chǔ)繪制三維因變量面 （Response Surface）和二維等高圖，分別見圖4、圖5。

圖4 效應(yīng)面圖

圖5 等高線圖

2.3.4.3 效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測 通過對(duì)上述三維因變量效應(yīng)面圖和等高線圖進(jìn)行分析，可以看出，綜合評(píng)分隨著加水倍量的增大而增大，隨著提取時(shí)間的增加而增大。因?yàn)榧铀读繉?duì)綜合評(píng)分有顯著性影響，而提取時(shí)間沒有顯著性影響，因此考慮到生產(chǎn)實(shí)際，確定本課題實(shí)驗(yàn)的最佳提取工藝為：提取2次，加14倍量的水，每次提取60min。

2.3.4.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 按處方精密稱取樣品3份，按照上述預(yù)測的最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測定提取液中鹽酸小檗堿含有量、總多糖含有量及浸膏得率，結(jié)果其綜合評(píng)分分別為93.56、93.18、92.50，平均綜合評(píng)分為93.08，而預(yù)測綜合評(píng)分為94.0，偏差為-0.98%，RSD為0.54%。

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)際測得的綜合評(píng)分值比預(yù)測值低0.98%，與模型預(yù)測值非常接近。說明采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法用于苓柏解毒丸提取工藝的優(yōu)化，結(jié)果較準(zhǔn)確，得到的工藝條件具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 討論

在中藥研究中，往往需要獲取最佳的工藝條件和最佳的處方配比等，而且要求通過適宜的數(shù)學(xué)方法建立精度高、預(yù)測性好的回歸模型。因此選擇試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法時(shí)，要綜合考慮試驗(yàn)點(diǎn)的安排，數(shù)據(jù)處理與回歸模型的精度。CCD適宜于回歸模型為二次或二次以上的非線性模型的實(shí)驗(yàn)［1］。因中藥成分復(fù)雜且有效成分的含有量相對(duì)較低，在提取過程中常常會(huì)受到諸多因素的影響，提取方法不同，影響因素也不同，這些因素的變化對(duì)結(jié)果的影響至關(guān)重要，效應(yīng)面法（response surfacemethodology）就是研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)因素關(guān)系的方法。在效應(yīng)面的一階設(shè)計(jì)中通常用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)，而在效應(yīng)面的二階設(shè)計(jì)中，為使實(shí)驗(yàn)區(qū)在接近響應(yīng)曲面的最優(yōu)區(qū)域后，能更精確逼近最優(yōu)值并且識(shí)別出最優(yōu)工藝條件，通常用星點(diǎn)設(shè)計(jì)、Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及回歸實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)［2］。星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法主要考察自變量對(duì)效應(yīng)變量的作用并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。要求自變量必須連續(xù)而且可由試驗(yàn)者準(zhǔn)確控制［13］。根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)的原理，每個(gè)因素設(shè)5水平，在本實(shí)驗(yàn)中各因素的極大、極小水平主要根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果和工業(yè)化大生產(chǎn)從節(jié)約成本的角度而定。

在測定鹽酸小檗堿含有量時(shí)，曾采用了多種不同的供試品處理方法及色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)。首先采用了2010年版《中國藥典》黃柏項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行了研究，即流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液 （50∶50）（每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.1 g）；柱溫30℃；體積流量1 mL/min；檢測波長265 nm。結(jié)果得到的色譜圖中各成分分離度較差。后又采用乙腈-0.03mol/mL磷酸二氫鈉（25∶75）［5］、50 mmol/L的磷酸二氫鉀溶液-乙腈 （55∶45） （以磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0，加入十二烷基硫酸鈉至終溶液濃度25mmol/L）［6］、乙腈-0.3%磷酸溶液 （20∶80）［7］等多種流動(dòng)相進(jìn)行研究，均未能得到理想的色譜圖。而當(dāng)采用色譜條件：乙腈-0.1%磷酸溶液 （42∶58） （每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.1 g）；柱溫40℃；體積流量1 mL/min；檢測波長265 nm時(shí)，得到的色譜圖峰形較好，分離度較理想。

因提取液中的鹽酸小檗堿含有量較低，因此對(duì)提取液進(jìn)行了濃縮，結(jié)果經(jīng)方法學(xué)考察各項(xiàng)指標(biāo)均符合含量測定的要求。

致謝 孫奇老師為本文中的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析提供幫助。

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R284.2

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：1001-1528（2015）07-1617-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.053

2014-03-15

王 萍 （1965—），女，碩士，主任藥師，研究方向?yàn)橹兴幮滤庨_發(fā)。Tel：（0991）5814127，E-mail：xjwp123@126.com