■程志斌 白華毅 蘇子峰 廖國周，4 畢保良 趙 平 潘洪彬 黃麗梅 汪 霞 樊月圓

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南昆明 650201；2.云南省動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南昆明 650201；3.大理學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003；4.云南省畜產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，云南昆明 650201）

我們前期的試驗(yàn)（程志斌等，2014；姜自琴等，2014）及他人（Sabater-Molina等，2009；何余湧等，2012；趙宏濤等，2015）的多個試驗(yàn)證明，口服精胺具有促進(jìn)幼齡仔豬腸道發(fā)育及生產(chǎn)性能的作用。然而，精胺促進(jìn)仔豬腸道發(fā)育的機(jī)制尚不明確，這影響了精胺在養(yǎng)豬實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用推廣。大量試驗(yàn)研究與綜述顯示：幼齡仔豬腸道的發(fā)育及腸黏膜二糖酶的比活力受到激素和多種生物活性分子的調(diào)控（Henning，1981；Arsenault等，1984；Chapple等，1989；Morisset，1992；Xu等，2000；趙宏濤等，2015）。就激素而言，血漿皮質(zhì)醇顯著影響幼齡動物腸道發(fā)育及腸黏膜二糖酶活性（Henning，1981；Morisset，1992；趙宏濤等，2015）。過去的試驗(yàn)數(shù)據(jù)證明：血漿皮質(zhì)醇濃度與幼齡動物小腸黏膜麥芽糖酶和蔗糖酶比活力呈顯著正相關(guān)（Arsenault等，1984；Chapple等，1989）；幼齡仔豬肌肉注射皮質(zhì)醇，可以顯著提高小腸黏膜麥芽糖和蔗糖酶比活力（Martin等，1982；Chapple等，1989）；相反，幼齡仔豬肌肉注射皮質(zhì)醇激素抑制劑（例如：metyrapone，甲雙吡丙酮）可以明顯抑制小腸發(fā)育期的黏膜麥芽糖和蔗糖酶比活力，進(jìn)而抑制腸道組織發(fā)育（Wu等，2000）。這些試驗(yàn)提示，口服外源精胺是否具有激發(fā)血漿皮質(zhì)醇發(fā)揮促進(jìn)哺乳仔豬腸道發(fā)育的作用機(jī)理，有待試驗(yàn)驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與分組

試驗(yàn)選取6頭“長白×大白”妊娠母豬所產(chǎn)的6窩哺乳仔豬進(jìn)行試驗(yàn)。仔豬出生后6 h，每頭母豬窩仔數(shù)統(tǒng)一為10頭。0日齡定義為第一頭仔豬出生日，仔豬0～10日齡維持正常的哺乳。哺乳第11日齡的早晨07∶00～07∶30，每窩選取4頭共24頭體重最相近、健康狀況良好的仔豬[初始體重(3.58±0.05)kg]進(jìn)行試驗(yàn)。

試驗(yàn)處理組設(shè)計(jì)見表1，具體如下：試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，以窩別為區(qū)組，同窩的每頭仔豬為試驗(yàn)重復(fù)和單元，將同窩選取的4頭試驗(yàn)仔豬隨機(jī)分配到4個處理組中的一個。4個處理組分別為：處理組1，口服生理鹽水和注射生理鹽水；處理組2，口服0.4 mmol/(kg BW·d)精胺和注射生理鹽水；處理組3，口服生理鹽水和肌肉注射5 mg/(kg BW·d)甲雙吡丙酮；處理組4，注射5 mg/(kg BW·d)甲雙吡丙酮和口服0.4 mmol/(kg BW·d)精胺。根據(jù)我們前期試驗(yàn)結(jié)果（程志斌等，2014；姜自琴等，2014），試驗(yàn)選取口服0.4 mmol/（kg BW·d）精胺。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2 精胺與甲雙吡丙酮

精胺為Sigma公司產(chǎn)品，口服精胺溶液由0.9%生理鹽水配制成濃度50 μmol/ml。甲雙吡丙酮用生理鹽水配制成濃度10 mg/ml。

1.3 飼糧組成

母豬的哺乳日糧按NRC（1998）營養(yǎng)推薦量配制玉米-豆粕型粉料，日糧組成和營養(yǎng)水平見表2。

表2 試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)水平

1.4 飼養(yǎng)管理

哺乳母豬采用單欄飼喂管理，欄圈面積1.5×2.1 m2，乳頭式飲水器自由飲水，哺乳日糧不限飼，飼喂時間為每日08∶00和17∶00。產(chǎn)仔舍的溫度控制在(22±2)℃，仔豬保溫箱通過加熱燈維持溫度(32±2)℃，產(chǎn)仔舍保持24 h光照。專門飼養(yǎng)員管理母豬采食情況，母豬采食后，剩余在料槽和拋灑在地面的飼料立即清掃干凈，以防止仔豬采食。同時，哺乳全期所有仔豬不提供補(bǔ)料。在3 d的試驗(yàn)期中，試驗(yàn)仔豬和母豬健康狀況良好。

1.5 試驗(yàn)過程與取樣

參考Wu等（2000）的試驗(yàn)報(bào)道，按照表1試驗(yàn)設(shè)計(jì)，本試驗(yàn)建立仔豬血漿皮質(zhì)醇抑制模型的試驗(yàn)過程具體如下：在11～13 d的早晨07∶00，所有試驗(yàn)仔豬按照處理組不同，分別注射生理鹽水或甲雙吡丙酮，口服生理鹽水或精胺溶液，每天一次，持續(xù)3 d。血漿皮質(zhì)醇抑制劑（甲雙吡丙酮）的注射劑量是5 mg/(kg BW·d)。

13 d早晨07∶00，24頭試驗(yàn)仔豬試驗(yàn)操作結(jié)束后2 h，所有試驗(yàn)仔豬頸靜脈放血致死，采集血樣分析血漿皮質(zhì)醇濃度。

所有處理組空腸從小腸中點(diǎn)約50%處采樣，取空腸20 cm黏膜，用于分析麥芽糖酶和乳糖酶比活力。同時，采集2 cm空腸，用10%甲醛溶液固定，用于分析絨毛高度和隱窩深度。

1.6 檢測方法

所有分析檢測在云南省動物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。血漿皮質(zhì)醇使用放免法測定。二糖酶比活力測定參考我們前期報(bào)道的方法（姜自琴等，2014）。腸道絨毛高度和隱窩深度的測定參考李旋亮等（2014）和郭小云等（2015）的方法。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用單因素方差分析和Student-Newman-Keuls多重比較，統(tǒng)計(jì)顯著性用P＜0.05表示。統(tǒng)計(jì)軟件使用SPSS 11.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 血漿皮質(zhì)醇濃度（見圖1）

處理組1～4哺乳仔豬血漿皮質(zhì)醇濃度分別為20.5、25.8、5.1、12.1 μg/l。注射甲雙吡丙酮的處理組3和處理組4仔豬血漿皮質(zhì)醇濃度低于處理組1（P＜0.05）；處理組2口服精胺仔豬血漿皮質(zhì)醇濃度高于處理組1（P＜0.05）；處理組4血漿皮質(zhì)醇濃度高于處理組3（P＜0.05）。

2.2 空腸黏膜二糖酶比活力（見圖2和圖3）

處理組1～4哺乳仔豬空腸黏膜麥芽糖酶比活力分別為118.5、195.3、88.3、144.2 U/g（腸黏膜蛋白）。處理組2仔豬空腸黏膜麥芽糖酶比活力顯著高于處理組1、處理組4和處理組3（P＜0.05）；處理組1和處理組4麥芽糖酶比活力差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于處理組3（P＜0.05）。

圖1 肌肉注射甲雙吡丙酮和口服精胺對哺乳仔豬血漿皮質(zhì)醇濃度的影響

圖2 肌肉注射甲雙吡丙酮和口服精胺對哺乳仔豬空腸麥芽糖酶比活力的影響

圖3 肌肉注射甲雙吡丙酮和口服精胺對哺乳仔豬空腸乳糖酶比活力的影響

處理組1～4哺乳仔豬空腸黏膜乳糖酶比活力分別為143.7、95.8、153.2、115.2 U/g（腸黏膜蛋白）。處理組1和處理組3仔豬空腸黏膜乳糖酶比活力差異不顯著（P＞0.05），顯著高于處理組2和處理組4（P＜0.05），處理組2和處理組4之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 空腸絨毛高度和隱窩深度（見圖4和圖5）

圖4 肌肉注射甲雙吡丙酮和口服精胺對哺乳仔豬空腸絨毛高度的影響

圖5 肌肉注射甲雙吡丙酮和口服精胺對哺乳仔豬空腸隱窩深度的影響

處理組1～4哺乳仔豬空腸絨毛高度分別為780.5、624.2、761.7、647.5 μm。處理組1和處理組3絨毛高度差異不顯著（P＞0.05），顯著高于處理組2和處理組4（P＜0.05），處理組2和處理組4絨毛高度差異不顯著（P＞0.05）。

處理組1～4哺乳仔豬空腸隱窩深度分別為148.3、174.3、140.8、167.5 μm。處理組2和處理組4隱窩深度差異不顯著（P＞0.05），但顯著大于處理組1和處理組3（P＜0.05），處理組1和處理組3隱窩深度差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

精胺存在于所有真核細(xì)胞和原核細(xì)胞中，在哺乳動物細(xì)胞的增殖、增生和分化等生物過程中有重要的生理作用，尤其是對幼齡哺乳動物的小腸黏膜上皮細(xì)胞等快速增殖和分化的組織細(xì)胞（Sabater-Molina等，2009；程志斌等，2014；姜自琴等，2014）。近年來，已有大量試驗(yàn)證明（Sabater-Molina等，2009；何余湧等，2012；程志斌等，2014；姜自琴等，2014；趙宏濤等，2015）：口服精胺具有促進(jìn)幼齡仔豬腸道發(fā)育的作用，在養(yǎng)豬生產(chǎn)實(shí)際中有應(yīng)用的潛能。由于精胺促進(jìn)幼齡仔豬腸道發(fā)育的機(jī)制尚不明確，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)皮質(zhì)醇抑制模型，初步探索精胺促進(jìn)哺乳仔豬腸道發(fā)育和成熟的機(jī)理。

3.1 皮質(zhì)醇抑制模型的建立

圖1血漿皮質(zhì)醇濃度結(jié)果顯示：注射甲雙吡丙酮的處理組3和處理組4仔豬血漿皮質(zhì)醇濃度顯著低于處理組1（P＜0.05），本試驗(yàn)?zāi)Ｐ团cWu等（2000）結(jié)果一致。說明本試驗(yàn)成功的建立了皮質(zhì)醇抑制模型，此模型適合用于本次試驗(yàn)研究口服精胺促進(jìn)哺乳仔豬腸道發(fā)育的機(jī)制。

處理組2仔豬血漿皮質(zhì)醇濃度顯著高于處理組1（P＜0.05），說明口服外源精胺激發(fā)了仔豬血漿皮質(zhì)醇分泌，這一結(jié)果與趙宏濤等（2015）在日糧添加精胺促進(jìn)哺乳仔豬血漿皮質(zhì)醇濃度提高的結(jié)果一致。此外，Kaouass等（1994）用大鼠試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，口服精胺提高了哺乳大鼠的血漿皮質(zhì)醇濃度。以上結(jié)果提示，精胺可能通過激發(fā)皮質(zhì)醇間接促進(jìn)哺乳仔豬小腸的發(fā)育。

進(jìn)一步分析顯示（見圖1）：同時注射甲雙吡丙酮和口服精胺的仔豬（處理組4）血漿皮質(zhì)醇濃度，比處理組3未口服精胺且注射甲雙吡丙酮的仔豬血漿皮質(zhì)醇濃度高（P＜0.05），但仍然低于處理組1（P＜0.05）。這一結(jié)果證明，在抑制皮質(zhì)醇模型下，口服精胺雖然顯著提高了仔豬血漿皮質(zhì)醇濃度，但血漿皮質(zhì)醇濃度不能恢復(fù)到正常哺乳仔豬的水平。

綜合以上皮質(zhì)醇抑制模型的試驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，口服外源精胺有激發(fā)哺乳仔豬合成和分泌皮質(zhì)醇的作用。在此模型基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步分析標(biāo)志小腸發(fā)育的黏膜二糖酶活性和腸道形態(tài)。

3.2 口服精胺激發(fā)皮質(zhì)醇對哺乳仔豬腸道黏膜二糖酶的影響

小腸黏膜二糖酶比活力是幼齡仔豬腸道發(fā)育的重要指標(biāo)之一，可以作為腸道發(fā)育的標(biāo)識（Henning，1981；Chapple等，1989；Xu等，2000；Mateo等，2014；喬家運(yùn)等，2014；汪珊如等，2015）。血漿皮質(zhì)醇對仔豬腸道發(fā)育的影響體現(xiàn)在小腸黏膜麥芽糖酶和蔗糖酶活性的調(diào)控作用（Arsenault等，1984；Morisset，1992；Xu等，2000；趙宏濤等，2015）。一般而言，隨著哺乳仔豬日齡增加，血漿皮質(zhì)醇濃度升高，并顯著提高小腸黏膜麥芽糖活性，降低小腸黏膜乳糖酶活性（Chapple等，1989；Xu等，2000；姜自琴等，2014；趙宏濤等，2015）。

圖2顯示：處理組3注射皮質(zhì)醇抑制劑甲雙吡丙酮的仔豬空腸黏膜麥芽糖酶比活力顯著低于處理組1（P＜0.05），說明血漿皮質(zhì)醇的濃度降低抑制了哺乳仔豬空腸黏膜麥芽糖酶活性的增加，這與Chapple等（1989）和Wu等（2000）的結(jié)果一致。由此可見，血液皮質(zhì)醇的正常生理濃度對幼齡哺乳動物小腸的正常發(fā)育至關(guān)重要（Arsenault等，1984；Chapple等，1989；Xu等，2000；Wu等，2000）。另一方面也證明：本試驗(yàn)建立的皮質(zhì)醇抑制模型適合用來研究精胺激發(fā)皮質(zhì)醇間接促進(jìn)腸道發(fā)育的作用機(jī)理。

處理組4仔豬同時口服精胺和注射甲雙吡丙酮，空腸黏膜麥芽糖酶比活力顯著高于處理組3（P＜0.05），與處理組1相比差異不顯著。這一結(jié)果說明，在抑制血漿皮質(zhì)醇模型下，口服精胺使皮質(zhì)醇抑制仔豬的空腸黏膜麥芽糖酶比活力恢復(fù)到正常哺乳仔豬水平。這證明精胺作用空腸上皮細(xì)胞，提高麥芽糖酶比活力的直接作用機(jī)制。然而，處理組4空腸黏膜麥芽糖酶比活力與處理組3相比雖然顯著提高，但仍然未達(dá)到處理組2口服精胺仔豬的空腸黏膜麥芽糖酶比活力水平。同樣口服精胺，處理組4與處理組2相比，空腸黏膜麥芽糖酶比活力的降低顯然是因?yàn)樵谘獫{皮質(zhì)醇抑制條件下，較低的血漿皮質(zhì)醇濃度使口服精胺不能完全逆轉(zhuǎn)低水平血漿皮質(zhì)醇導(dǎo)致的麥芽糖酶比活力降低。由此可見，從以上黏膜麥芽糖酶比活力數(shù)據(jù)指標(biāo)說明，精胺對小腸發(fā)育和成熟的促進(jìn)效果是通過激發(fā)血漿皮質(zhì)醇實(shí)現(xiàn)的。

此外，圖3顯示：在抑制血漿皮質(zhì)醇條件下，處理組1（正常皮質(zhì)醇濃度）和處理組3（抑制皮質(zhì)醇濃度）空腸乳糖酶比活力差異不顯著。這一結(jié)果說明，血漿皮質(zhì)醇對乳糖酶無調(diào)控作用。這與Martin等（1982）用大鼠試驗(yàn)、Chapple等（1989）用仔豬試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)血漿皮質(zhì)醇濃度不影響乳糖酶比活力的結(jié)論一致。Henning（1981）和Morisset（1992）綜述顯示：無論是豬還是大鼠，黏膜乳糖酶酶蛋白合成和乳糖酶比活力表達(dá)的調(diào)控機(jī)制與麥芽糖酶不同，血漿皮質(zhì)醇只能影響麥芽糖酶比活力，對黏膜乳糖酶比活力沒有顯著影響。

3.3 口服精胺激發(fā)皮質(zhì)醇對哺乳仔豬腸絨毛高度和隱窩深度的影響

在抑制血漿皮質(zhì)醇條件下，處理組1和處理組3空腸絨毛高度差異不顯著，說明血漿皮質(zhì)醇對腸形態(tài)學(xué)無顯著影響（圖4）。無論是否注射甲雙吡丙酮，兩組口服精胺的仔豬（處理組2和處理組4）空腸絨毛高度與處理組1未口服精胺的仔豬相比均顯著降低（P＜0.05），這充分說明口服精胺的直接作用是降低了空腸絨毛高度。圖5腸隱窩深度的測定結(jié)果也顯示了相似結(jié)果，無論是否注射甲雙吡丙酮，兩組口服精胺的仔豬（處理組2和處理組4）空腸隱窩深度與處理組1未口服精胺的仔豬相比，均顯著提高（P＜0.05）。因此，綜合以上結(jié)果：空腸形態(tài)學(xué)絨毛高度和隱窩深度的試驗(yàn)結(jié)果均說明，口服精胺雖激發(fā)皮質(zhì)醇分泌，但無通過皮質(zhì)醇分泌影響腸道形態(tài)學(xué)的作用效果。

腸絨毛高度和隱窩深度這兩個形態(tài)學(xué)指標(biāo)是反映小腸上皮細(xì)胞發(fā)育與功能狀況的重要標(biāo)志（Hampson，1986；Morisset，1992；Xu等，2000；程志斌等，2014；李旋亮等，2014；喬家運(yùn)等，2014）。絨毛高度降低說明腸上皮細(xì)胞更新和衰亡的平衡打破，可能的原因包括兩個方面：其一，腸上皮細(xì)胞在外因作用下更新的速度降低，這體現(xiàn)在隱窩深度降低或者不變，隱窩干細(xì)胞的分裂和分化速度降低。典型的例子是禁食或者采食量降低引起的腸絨毛高度降低（Morisset，1992；Xu等，2000；程志斌等，2014）；其二，上皮細(xì)胞在外因誘導(dǎo)下加快了凋亡速度，隱窩深度提高，隱窩干細(xì)胞加速分裂和分化，以彌補(bǔ)腸絨毛上皮細(xì)胞的損失，盡量恢復(fù)絨毛高度，使動物盡快適應(yīng)腸道逆境。典型的例子包括各類抗?fàn)I養(yǎng)因子致使的仔豬絨毛高度降低和隱窩深度提高（Hampson，1986；喬家運(yùn)等，2014；郭小云等，2015）。顯然，本次試驗(yàn)口服精胺引起的腸絨毛高度降低和隱窩深度提高，屬于第二種情況，說明幼齡哺乳仔豬口服精胺使腸絨毛成熟的形態(tài)學(xué)變化從斷奶階段提前至哺乳階段，提前發(fā)育成熟的腸道有利于仔豬應(yīng)付斷奶后的綜合應(yīng)激。這一結(jié)果符合仔豬實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)的需求，尤其是早期斷奶技術(shù)在生產(chǎn)中的應(yīng)用。此外，這一結(jié)果也提示：口服的精胺沒有通過皮質(zhì)醇分泌影響腸道形態(tài)學(xué)，更有可能是精胺直接作用于腸黏膜上皮細(xì)胞的效應(yīng)。當(dāng)然，這一推測有待于進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過皮質(zhì)醇抑制模型證明，口服外源精胺可以通過血漿皮質(zhì)醇促進(jìn)幼齡仔豬腸道發(fā)育，其主要機(jī)制體現(xiàn)在小腸麥芽糖酶活性的提高。

（參考文獻(xiàn)18篇，刊略，需者可函索）