膿毒癥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

郭松喜1王丹2劉春生3

張睢揚(yáng)1王英1

作者單位： 100000 北京，第二炮兵總醫(yī)院呼吸科1、藥劑科2、骨科3

【關(guān)鍵詞】膿毒癥;動(dòng)物模型;微透析技術(shù)

膿毒癥(sepsis)是指由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，盡管近年來抗生素治療取得了新的進(jìn)展，但膿毒癥病死率仍呈現(xiàn)不斷上升的趨勢[1]。究其原因是我們?nèi)圆荒軐?duì)膿毒癥的發(fā)生發(fā)展有一個(gè)準(zhǔn)確的監(jiān)測。制備與膿毒癥疾病高擬合度的動(dòng)物模型至關(guān)重要，精準(zhǔn)、動(dòng)態(tài)的取樣技術(shù)與監(jiān)測方法亦不可或缺，例如微透析(microdialysis, MD)技術(shù)[2]?，F(xiàn)就近十年來膿毒癥動(dòng)物模型的研究進(jìn)展做一綜述。

一、膿毒癥動(dòng)物模型的基本要求

根據(jù)膿毒癥的發(fā)病因素、病理生理學(xué)變化以及臨床特征，膿毒癥動(dòng)物模型必須具備以下基本要素：①有膿毒癥典型的高排低阻血流動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)和高代謝狀態(tài)；②伴發(fā)多個(gè)器官功能障礙；③有較高的自然死亡率，根據(jù)膿毒癥的轉(zhuǎn)歸，要求動(dòng)物模型的自然死亡率達(dá)到50%～70%；④膿毒癥是嚴(yán)重感染引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)過度激活造成的自身損傷，不是細(xì)菌和內(nèi)毒素對(duì)機(jī)體的直接損傷，故出現(xiàn)器官功能障礙及動(dòng)物死亡距膿毒癥模型制備應(yīng)有一定的時(shí)間間距。一般在制模后6～12 h后發(fā)生的器官功能障礙或死亡屬全身炎癥反應(yīng)所致[3]。

二、常用的膿毒癥模型

1.盲腸結(jié)扎一穿孔(cecal ligation and puncture, CLP)： 按預(yù)先設(shè)計(jì)好的嚴(yán)重程度結(jié)扎不同位置的盲腸，然后刺穿盲腸(或者用絲線縫穿盲腸并將絲線線圈留置)并將盲腸回納，連續(xù)縫合關(guān)腹即可完成CLP模型的制作。CLP膿毒癥模型被認(rèn)為是研究膿毒癥潛在機(jī)制的理想模型，主要優(yōu)點(diǎn)之一是能夠誘導(dǎo)不同嚴(yán)重程度的膿毒癥[4]。膿毒癥的嚴(yán)重程度與盲腸結(jié)扎長度、穿孔針的大小和穿孔數(shù)量等有關(guān)。Huber-Lang等[5]使用CLP方法成功制造了膿毒癥和膿毒癥休克模型，研究發(fā)現(xiàn)與單純的實(shí)行CLP操作及單獨(dú)阻斷白細(xì)胞分化抗原14(cluster of differentiation 14, CD14)或者補(bǔ)體C5(complement C5)相比，雙阻斷CD14和補(bǔ)體C5可以明顯提高膿毒癥大鼠的生存率，特定的阻斷CD14和補(bǔ)體C5或許可以作為治療膿毒癥的一種新策略。Wu等[6]研究發(fā)現(xiàn)在CLP組，肝臟及肺泡上皮細(xì)胞顯示腫脹、變性、壞死及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，而在人參皂苷Rb1(ginsenoside Rb1)組則顯示輕度變性及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，但是沒有壞死，這也許是人參皂苷Rb1通過改善動(dòng)脈血壓、下調(diào)Toll樣受體4信使核糖核酸(Toll-like receptor 4 Messenger RNA，TLR4 mRNA)的表達(dá)及阻止腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的生成起到保護(hù)膿毒癥大鼠的肝臟和肺臟免受損害，提高了其生存率。

2. 腹腔細(xì)菌接種: Ahernholz等采用纖維蛋白-糞便凝塊，將其種植到腹腔，既能防止糞便中的細(xì)菌被過快吸收，又能使細(xì)菌持續(xù)性釋放入血，避免了大量細(xì)菌進(jìn)入腹腔迅速彌散而產(chǎn)生中毒性休克。這種方法制作的模型雖然可產(chǎn)生類似膿毒癥患者的細(xì)胞因子反應(yīng)，但很少發(fā)生器官功能障礙和血液動(dòng)力學(xué)改變。為此，有人在纖維蛋白-糞便凝塊模型的基礎(chǔ)上，增加腸道缺血—再灌注進(jìn)行二次打擊，制作嚴(yán)重膿毒癥和器官損害模型。楊景程等[7]通過在腹腔注射熱滅活細(xì)菌菌液制造小鼠膿毒癥模型，實(shí)驗(yàn)觀察了中藥活性成分苦柯胺B(kukoamine B, KB)體內(nèi)外拮抗膿毒癥的藥理活性，得出苦柯胺B作為一種多病原分子的中和劑，能夠抑制炎癥介質(zhì)的釋放，發(fā)揮對(duì)膿毒癥模型小鼠的保護(hù)作用，且效果顯著優(yōu)于現(xiàn)有臨床用藥血必凈和烏司他丁。

3. 腹腔注射人糞便懸液: Connert等[8]改良了人糞便懸液腹腔注射法。收集并混合健康非素食人的糞便，迅速將其與預(yù)先配置的巰基乙酸鹽懸液按1︰1體積稀釋以優(yōu)化細(xì)菌生長，加入過氧化氫酶( 0.19 mg/100 ml) 以滅活活性氧。懸液中加入10%甘油，厭氧條件下勻漿。然后將處理好的人糞便懸液按實(shí)驗(yàn)?zāi)康慕?jīng)大鼠右下腹腹腔注射。Swarbreck等[9]通過腹腔注射人糞便懸液建立了膿毒癥小鼠模型，研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥了增加所有體液和器官中細(xì)菌的含量、纖溶酶原激活劑抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)的信使核糖核酸含量以及肺和肝中的酶活性。膿毒癥可增加肺及肝中髓過氧化物酶的水平，但在脾中卻降低。因此，抗壞血酸鹽對(duì)膿毒癥小鼠骨骼肌毛細(xì)血管堵塞的快速反應(yīng)并不伴隨著PAI-1改變或髓過氧化物酶反應(yīng)而發(fā)生。

4. 細(xì)菌或內(nèi)毒素血癥模型: 膿毒癥是細(xì)菌及其細(xì)胞壁主要成分—脂多糖(lipopoly saccharide, LPS)釋放入血導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)。理論上，靜脈注射細(xì)菌或LPS能引起機(jī)體炎癥介質(zhì)釋放，模擬急性全身炎癥反應(yīng)的癥狀。根據(jù)輸注細(xì)菌或加內(nèi)毒素的速度和量可以分為3種：大劑量單次輸注、小劑量單次輸注和小劑量持續(xù)輸注。小劑量單次輸注所制作的模型器官功能損害可能不明顯，死亡率低，不符合膿毒癥的預(yù)后規(guī)律。同單次輸注致死量(大劑量單次輸注)的模型相比，持續(xù)小劑量注射法模型的促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子呈低水平升高，但維持時(shí)間長，動(dòng)物長時(shí)間地呈現(xiàn)高排低阻的血液動(dòng)力學(xué)變化和高代謝狀態(tài)，與膿毒癥患者的病理生理和臨床表現(xiàn)較為相似。陳明祺等[10]通過持續(xù)小劑量靜脈注射脂多糖(LPS，5 mg/kg)建立膿毒癥模型，研究了膿毒癥小鼠的炎癥反應(yīng)及免疫功能。病理切片表明在LPS輸注2 h后模型組及四逆湯組均出現(xiàn)腸黏膜中炎癥細(xì)胞嚴(yán)重浸潤，絨毛嚴(yán)重破壞，而12 h后四逆湯組較模型組炎癥細(xì)胞浸潤有所減輕，腸絨毛的修復(fù)亦較明顯。得出四逆湯可以調(diào)節(jié)全身炎癥反應(yīng)系統(tǒng)，促進(jìn)膿毒癥小鼠的腸黏膜、腸道功能及免疫狀態(tài)的修復(fù)。Skorup等[11]通過持續(xù)小劑量靜脈注射大腸桿菌建立了豬的膿毒癥模型，研究表明對(duì)于革蘭陰性菌感染的嚴(yán)重膿毒癥或膿毒癥休克的早期階段，在內(nèi)酰胺類抗生素的基礎(chǔ)上聯(lián)合一種氨基糖苷類抗生素能增強(qiáng)抗菌作用。

5. 燒傷膿毒癥: 燒傷膿毒癥及其誘發(fā)的膿毒性休克和多器官功能障礙綜合征，已成為燒傷患者死亡的主要原因之一，因此，膿毒癥的早期診斷對(duì)其治療有重要意義。Shi等[12]制造了燒傷加綠膿桿菌感染的膿毒癥模型，得出銀耳多糖可以抑制燒傷加綠膿桿菌感染的膿毒癥小鼠CD4(+)CD25高表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞的異?；顒?dòng)，至少可以減少白細(xì)胞介素10(interleukin-10, IL-10)的分泌，并能夠激發(fā)活化的 CD4(+)T 細(xì)胞Th2向Th1的轉(zhuǎn)變。此外，銀耳多糖能明顯降低燒傷膿毒癥小鼠的死亡率。

6. 腹膜炎膿毒癥: Melo等[13]通過向小鼠腹腔注射糞便制造了自發(fā)性腹膜炎，并觀察了腹膜炎進(jìn)展至膿毒癥的過程，得出對(duì)于沒有永久雙邊頸動(dòng)脈閉塞(permanent bilateral carotid occlusion, PBCO)的年幼大鼠，靜脈注射莫西沙星及地塞米松治療嚴(yán)重糞便腹膜炎是非常有效的，對(duì)于合并有PBCO，甚至是腹腔和胸腔有殘存膿腫的老年大鼠亦能達(dá)到一定的效果。陳海鳴等[14]通過升結(jié)腸支架置入制造了腹膜炎模型，得出其操作簡單，具有可重復(fù)性，可以模仿人類彌漫性腹膜炎疾病過程，適用于外科膿毒癥的研究。并且升結(jié)腸支架置入腹膜炎模型可以模擬臨床上患者腸瘺的病理生理變化，由早期出現(xiàn)的體溫下降，白細(xì)胞及炎癥因子增高及菌血癥反應(yīng)，最終引起致死性膿毒癥反應(yīng)。

7. 其他: 膿毒癥常見靶部位有肺、腎、骨髓、血液系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、膽道系統(tǒng)等，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪€有很多制造膿毒癥的方法，例如：Maybauer等[15]在氣管切開造口處灌輸銅綠假單胞菌制造了羊嚴(yán)重膿毒癥模型，研究了選擇性血管加壓素1型受體激動(dòng)劑對(duì)嚴(yán)重膿毒癥的作用，得出膿毒癥復(fù)蘇時(shí)使用選擇性抗利尿激素1a型受體激動(dòng)劑比1a型受體激動(dòng)劑和V2型受體激動(dòng)劑的混合劑能更有效防止血管阻塞。Hestenes等[16]在完成內(nèi)側(cè)胸骨切開術(shù)后，向其內(nèi)注射了大腸桿菌，建立了豬膿毒癥模型，探討了嚴(yán)重膿毒癥的心肌功能障礙，研究表明張力超聲心動(dòng)圖可以在射血分?jǐn)?shù)和心輸出量顯著變化之前反映心肌功能障礙，其有望成為臨床評(píng)估膿毒癥的一項(xiàng)有用工具。

三、膿毒癥動(dòng)物模型評(píng)價(jià)指標(biāo)

1. 膿毒癥成模標(biāo)準(zhǔn): 動(dòng)物出現(xiàn)發(fā)熱，心率、呼吸頻率明顯加快，口鼻腔分泌物增多，精神萎靡，嗜睡，蜷縮，豎毛，少動(dòng)，拒食或少食，眼角出現(xiàn)分泌物，血培養(yǎng)陽性等為模型成功。膿毒癥標(biāo)準(zhǔn)加上至少一個(gè)器官功能障礙為嚴(yán)重膿毒癥成模標(biāo)準(zhǔn)。

2. 監(jiān)測指標(biāo)

(1)血標(biāo)本檢測：

① C-反應(yīng)蛋白(C-Reactive Protein，CRP)：對(duì)于膿毒癥的早期診斷及預(yù)后評(píng)估有重要價(jià)值。Park等[17]研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于伴有腎功能損傷的膿毒癥患者，CRP可作為一個(gè)準(zhǔn)確的感染指標(biāo)。雖然檢測降鈣素原(procalcitionin, PCT)的花費(fèi)要比CRP高，但是作為炎癥指標(biāo)，PCT的診斷價(jià)值并不優(yōu)于CRP。Alkhamis等[18]發(fā)現(xiàn)術(shù)前CRP水平是預(yù)測腫瘤患者發(fā)生膿毒癥的一個(gè)可靠指標(biāo)。

② 血清PCT：可作為早期鑒別全身感染及判斷膿毒血癥嚴(yán)重程度及預(yù)后的有效指標(biāo)。研究表明，PCT診斷膿毒癥有較好的敏感性和特異性，PCT<5.0 ng/ml對(duì)于膿毒癥有足夠的排除標(biāo)準(zhǔn)[19]。血漿中PCT濃度的升高不僅可以判斷是否存在全身細(xì)菌感染，而且可以反映感染的嚴(yán)重程度。Huang等[20]發(fā)現(xiàn)，PCT≥10.0 mg/L時(shí)，致病菌為革蘭陰性菌的幾率比革蘭陽性菌的幾率大。雖然血清PCT和CRP水平均可用于細(xì)菌性膿毒癥的診斷和預(yù)后評(píng)估，但血清PCT的敏感性和特異性比血清CRP更好。

③ 乳酸：是診斷膿毒癥的有效指標(biāo)。緊急情況下乳酸水平可為心血管意外和組織低灌注提供早期線索，除了評(píng)估血清電解質(zhì)，血?dú)夥治鲆嘤兄谖Ｖ鼗颊叩呐R床評(píng)估和管理[21]。

(2) 微透析技術(shù)(MD)檢測：微透析技術(shù)可用于測定人體組織間液中的小分子和大分子物質(zhì)。Ditz等[22]發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠組織間質(zhì)中乳酸及甘油水平、肌肉組織中乳酸/丙酮酸比值及乳酸/葡萄糖比值均會(huì)明顯增高。Nikitas 等[23]通過微透析技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)即使在血乳酸水平正常(<2 mmol/L)的患者，脂肪組織中乳酸/丙酮酸比值的變化趨勢仍有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。死亡患者脂肪組織中乳酸/丙酮酸比值明顯高于幸存者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

(3) 尿液標(biāo)本檢測：中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)是一種分泌性蛋白。NGAL可作為早期預(yù)測及評(píng)價(jià)膿毒癥伴有急性腎損傷的一個(gè)獨(dú)立生物學(xué)標(biāo)記[24]。研究表明NGAL在正常腎組織中呈低水平表達(dá)，但在腎缺血/再灌注損傷和順鉑誘導(dǎo)小鼠腎損傷模型中，損傷后3 h時(shí)的尿液中即可檢測到NGAL，明顯早于尿N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(N-Acetyl-β-glucosaminase，NAG)、β2-微球蛋白、及血清肌酐(serum creatinine, SCr)的改變，是目前基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常選用的評(píng)價(jià)急性腎損傷的指標(biāo)[25]。

四、展望

盡管上述各種膿毒癥模型存在諸多局限，也沒有一種膿毒癥模型能完全再現(xiàn)膿毒癥的演變過程，但是膿毒癥模型對(duì)膿毒癥研究領(lǐng)域仍有不可替代的作用。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，制作不同的符合要求的膿毒癥模型，是研究膿毒癥的必不可少的一種手段。MD技術(shù)已被確立為一種可靠的體內(nèi)工具，具有在體、實(shí)時(shí)、在線取樣等優(yōu)勢，可精確檢測膿毒癥能量代謝產(chǎn)物乳酸、丙酮酸等。隨著MD技術(shù)在膿毒癥研究中的成熟，有望應(yīng)用MD技術(shù)準(zhǔn)確監(jiān)測膿毒癥演變過程，不斷完善膿毒癥動(dòng)物模型的制備，為膿毒癥疾病的研究，診治提供支持。

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(本文編輯：張大春)

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·綜述·

收稿日期：(2015-01-22)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：中圖法分類號(hào)： R563 A

通訊作者：王英，Email：lilywang0701@sina.cn

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(81301662)

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.05.025