張晶,黃蕊,郝玲,劉娜
(1河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院,石家莊050031;2定州市婦幼保健院)
圍產(chǎn)期缺氧缺血性腦損傷(HIBD)是新生兒常見疾病,是導(dǎo)致腦癱、癲癇、智力低下等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要原因之一,亦是引起新生兒死亡的重要原因[1]。目前,HIBD的發(fā)病機制尚不明確,動物實驗表明,HIBD能致神經(jīng)元細胞的壞死和凋亡,進而導(dǎo)致病理性癥狀的發(fā)生[2,3]。對HIBD引起的腦損傷目前尚無有效防治措施。促紅細胞生成素(EPO)是一種主要由腎臟和肝臟組織合成的糖蛋白,是調(diào)節(jié)血液中紅細胞增殖、分化與成熟的細胞因子。近年發(fā)現(xiàn)EPO受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達,對腦損傷神經(jīng)元具有保護作用[4,5]。本實驗通過建立HIBD大鼠模型,應(yīng)用EPO藥物對HIBD大鼠進行干預(yù)治療,分析EPO對HIBD腦組織的Fas、FasL表達的影響,探討EPO對HIBD大鼠神經(jīng)元可能的保護機制,從而為HIBD的臨床治療提供理論依據(jù)。
1.1 材料 實驗動物:新生7 d健康的Wistar大鼠120只,雌雄不限,體質(zhì)量12~18 g,由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。主要試劑:EPO注射液(沈陽三生制藥股份有限公司)。BCA蛋白濃度測定試劑盒、IP細胞裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)。TRIzol(美國Invitrogen公司),M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(日本TaKaRa公司),Real Master Mix試劑盒(德國Qiangen公司),GAPDH、Fas及 Fas配體(FasL)抗體(美國 SANTA CRUZ公司)。主要儀器:ABI7300(美國ABI公司),bio-rad垂直版電泳槽,常壓缺氧艙(河北有機玻璃廠)及氧濃度監(jiān)測儀(日本3A公司生產(chǎn),1H21A型),顯微鏡(OlympusH-CX31)。
1.2 模型制備、分組及干預(yù) 將Wistar大鼠用氯胺酮30 mg/kg腹腔注射麻醉后,游離左側(cè)頸總動脈,雙線結(jié)扎。將大鼠隨機分為假手術(shù)組(對照組)、HIBD組和EPO治療組各40只,根據(jù)處死大鼠的時間點(6、12、24、48、72 h)不同,進一步分為 5 個亞組,每個亞組平均8只大鼠。對照組僅分離左頸總動脈但不結(jié)扎血管及缺氧。EPO治療組在HIBD模型建立后立即腹腔注射重組人紅細胞生成素注射液(5 000 IU/kg),HIBD組腹腔注射等體積生理鹽水。模型組和EPO治療組缺血術(shù)后恢復(fù)2 h,置于2 000 mL常溫常壓缺氧艙內(nèi),以1.0~2.0 L/min的速度輸入體積分數(shù)為8%氧氣和體積分數(shù)為92%氮氣的混合氣體,以氧濃度監(jiān)測儀進行檢測,使氧濃度維持體積分數(shù)為8%,持續(xù)2 h。2 h后恢復(fù)正常供氧,制成HIBD動物模型(左側(cè)大腦半球)。上述動物均回籠飼養(yǎng),6、12、24、48、72 h 時分別隨機處死各組大鼠8只,取左側(cè)大腦半球,用于后續(xù)DNA模板和蛋白的提取。
1.3 腦組織中Fas及FasL mRNA表達檢測 采用Real-time PCR法。按TRIzol說明書提取大鼠腦組織標本中總RNA。RNA的濃度經(jīng)紫外線分光光度計測定:A260/A280=1.8~2.0,說明 RNA 的完整性較好,將濃度調(diào)整為500 ng/μL。采用TaKaRa公司RNA M-MLV kit試劑盒,在10 μL反應(yīng)體系中逆轉(zhuǎn)錄RNA合成cDNA,cDNA產(chǎn)物用于后續(xù)的擴增實驗或置于-20℃保存?zhèn)溆?。引物序?Fas上游引物:5'-CCTCCCATCCTCCTGACCACCG-3',下 游 引物:5'-CTGGTTGCCTTGGTAGGATTG-3',擴增片段117 bp;FasL上游引物:5'-TCCCTGGAGAAGAGCTACGA-3',下游引物:5'-TCACTCGTAAACCGCTTCCCTC-3',擴增片段 182 bp;β-actin上游引物:5'-CCTGTTAAATGGGCCACTTTC-3',下游引物:5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3',擴增片段 194 bp。20 μL 反應(yīng)總體積,取cDNA 1 μL,加 PCR mix buffer 10 μL,上下游引物各 0.6 μL,DEPC-H2O 為 7.8 μL。循環(huán)條件:95℃預(yù)變性5 min;94℃、30 s;56℃、30 s;72℃、45 s,40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后記錄相關(guān)Ct值,根據(jù) 2-ΔΔct公式計算各組中 Fas、FasL 基因的相對表達量。
1.4 腦組織中Fas及FasL蛋白表達檢測 采用Western blotting法。將大鼠的腦組織在冰浴條件上加細胞裂解液進行研磨并裂解30 min,15 000 r/min離心10 min,收集上清組織(總蛋白標本),利用CBA進行蛋白定量,按等量樣本30 μg上樣,10%SDS-PAGE凝膠電泳,80 V電泳至溴酚藍到分離膠后,上調(diào)電壓至100 V,直至溴酚藍到達凝膠底部約0.5 cm處停止電泳,80 V濕轉(zhuǎn)90 min,TBST洗滌,5%的脫脂奶粉封閉,室溫下?lián)u床維持1 h。TBST洗滌,加一抗,4℃冰箱搖床孵育過夜,TBST洗滌,孵育二抗30 min,TBST洗滌,ECL顯影,掃片,利用Bio-rad公司的圖形分析軟件Quantity one對條帶進行灰度值掃描,對結(jié)果進行定量分析。
1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示,多組間比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 各組腦組織中Fas、FasL mRNA表達比較 對照組在不同時點的大鼠腦組織中Fas mRNA相對表達量均維持在較低水平,在HIBD組6 h后處死的大鼠腦組織中,F(xiàn)as mRNA相對表達量開始增加,12 h時達最大值,隨后開始逐步下降,至72 h后Fas mRNA相對表達量降至接近基礎(chǔ)水平;在EPO治療組中,F(xiàn)as mRNA表達與HIBD組有相似的變化趨勢(先升高后降低),但變化幅度明顯減小,且在12、24、48 h時Fas mRNA表達均明顯低于HIBD組(P均<0.05)。FasL mRNA表達在HIBD組腦組織中6~24 h開始急劇增減,并在12~24 h維持很高的表達水平,24 h后開始下降,并降至接近基礎(chǔ)水平;6、12、24和48 h時EPO治療組FasL mRNA表達均顯著低于HIBD組(P均<0.05)。詳見表1、表2。
表1 三組不同時點Fas mRNA在腦組織中的相對表達量比較(±s)
表1 三組不同時點Fas mRNA在腦組織中的相對表達量比較(±s)
注:與 HIBD 組相比,*P <0.05;與 HIBD組相比,△P <0.01。
組別 n Fas mRNA相對表達量6 h 12 h 24 h 48 h 72 h HIBD 組 8 3.89 ±0.42 12.04 ±0.89 6.91 ±0.64 4.31 ±0.52 2.43 ±0.26 EPO 治療組 8 3.72±0.22 5.68±0.54△ 3.95 ±0.41△ 3.83±0.27* 1.79±0.28對照組 8 1.75 ±0.21 1.63 ±0.28 1.67 ±0.32 1.39 ±0.26 1.58 ±0.46
表2 三組不同時點FasL mRNA在腦組織中的相對表達量比較(±s)
表2 三組不同時點FasL mRNA在腦組織中的相對表達量比較(±s)
注:與 HIBD 組相比,*P <0.05;與 HIBD組相比,△P <0.01。
組別 n FasL mRNA相對表達量6 h 12 h 24 h 48 h 72 h HIBD 組 8 4.69 ±0.61 19.54 ±1.67 22.61 ±2.06 5.29 ±0.732.92 ±0.21 EPO 治療組 8 2.78±0.17* 6.94±0.78△ 6.25 ±0.52△ 3.12±0.36* 2.32±0.23對照組 8 1.52 ±0.20 1.73 ±0.31 1.82 ±0.35 1.42 ±0.27 1.48 ±0.34
2.2 各組腦組織中Fas、FasL蛋白表達比較 Fas蛋白的表達變化與在基因水平有類似趨勢(先升高后降低),在HIBD組24 h后Fas蛋白表達水平達到最高,之后有小幅度下降;EPO治療組總體表達變化不明顯,在12 h和24 h Fas蛋白水平有小幅度上升,但明顯低于HIBD組,且在24 h和48 h兩個時點的差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P均<0.05)。在HIBD組中FasL總體表達水平較Fas蛋白要高,在6 h后就維持在較高水平,在12 h和24 h的表達水平遠高于對照組,72 h后降至接近基礎(chǔ)水平;EPO治療組經(jīng)過EPO處理后,F(xiàn)asL蛋白表達水平顯著降低,在多個時點表達水平均低于HIBD組(P均<0.05)。詳見表3、表4。
新生兒HIBD是一種常見的新生兒疾病,可導(dǎo)致新生兒死亡或嚴重神經(jīng)系統(tǒng)損害,是造成胎兒偏癱、認知及智力障礙的重要病理基礎(chǔ)。HIBD重要的腦組織病理變化是大量神經(jīng)元細胞的變性、壞死或凋亡[6]。臨床目前尚無特異性的治療策略。最初發(fā)現(xiàn)EPO可增加紅細胞,促使組織的攜氧量提高,促進紅細胞的生存;動物實驗證明,其對神經(jīng)元亦有一定的保護作用[4]。本研究結(jié)果顯示,EPO干預(yù)HIBD大鼠后,在基因水平和蛋白水平上均可以下調(diào)大鼠腦組織中Fas、FasL表達,阻斷神經(jīng)元細胞的凋亡,保護腦組織神經(jīng)元細胞。這一發(fā)現(xiàn)為HIBD的靶向干預(yù)和臨床治療提供了新思路。
表3 三組不同時點Fas蛋白在腦組織中的相對表達量比較(±s)
表3 三組不同時點Fas蛋白在腦組織中的相對表達量比較(±s)
注:與 HIBD 組相比,*P <0.05,△P <0.01。
組別 n Fas 蛋白相對表達量6 h 12 h 24 h 48 h 72 h對照組 8 1.92 ±0.31 1.73 ±0.27 1.64 ±0.25 1.41 ±0.22 1.59 ±0.32 HIBD 組 8 3.27 ±0.27 3.84 ±0.89 5.71 ±0.56 4.09 ±0.36 2.34 ±0.18 EPO 治療組 8 3.72±0.22 5.68±0.54 3.95 ±0.41△ 3.83±0.27*1.79 ±0.28
表4 三組不同時點FasL蛋白在腦組織中的相對表達量比較(±s)
表4 三組不同時點FasL蛋白在腦組織中的相對表達量比較(±s)
注:與 HIBD 組相比,*P <0.05,△P <0.01。
組別 n FasL 蛋白相對表達量6 h 12 h 24 h 48 h 72 h對照組 8 1.67 ±0.18 1.82 ±0.23 1.25 ±0.17 1.91 ±0.57 1.62 ±0.42 HIBD 組 8 4.47 ±0.43 7.48 ±0.89 9.57 ±1.08 7.14 ±0.62 3.96 ±0.34 EPO 治療組 8 2.04±0.25* 2.57±0.23△ 3.01 ±0.27△ 1.92±0.16△ 1.35±0.11*
EPD是由人體肝臟和腎臟分泌的一種造血生長因子,一種耐熱的含唾液酸的酸性糖蛋白激素,相對分子質(zhì)量約34 kD,作用于骨髓造血干細胞,促進骨髓紅細胞增生與分化,對機體供氧狀況發(fā)揮重要的調(diào)控作用[7]。目前研究顯示,EPO是一種多效細胞因子,可促進紅系祖細胞分裂,增加循環(huán)中紅細胞數(shù)量[8]。研究[9,10]發(fā)現(xiàn),EPO 可通過與其受體結(jié)合,激活下游Janus激酶2(JAK2)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化蛋白3(STAT3)、磷脂酰肌醇3激酶 (PI3K)、蛋白激酶B(PKB)和NF-κB等信號通路,從而抑制神經(jīng)元凋亡。
細胞凋亡是HIBD導(dǎo)致神經(jīng)元細胞死亡的重要形式,但缺氧時神經(jīng)元細胞亦可發(fā)生壞死,主要取決于缺氧或缺血的嚴重程度。嚴重缺氧缺血時可引起能量衰竭,導(dǎo)致細胞內(nèi)外鈣離子平衡無法維持、細胞腫脹、細胞器破壞、神經(jīng)元細胞壞死等一系列生理病理過程改變,這種現(xiàn)象在缺血病灶中往往有較明顯表現(xiàn);如果缺血缺氧程度較輕時或在有效干預(yù)治療后,細胞形態(tài)無明顯改變,病理改變是選擇性神經(jīng)元的損傷,啟動少部分神經(jīng)元細胞內(nèi)相關(guān)凋亡基因,導(dǎo)致小部分神經(jīng)元出現(xiàn)程序性死亡。細胞壞死是不可控的過程,并會產(chǎn)生大量炎癥;而細胞凋亡是一個受精細調(diào)控的過程,是酶聯(lián)激活反應(yīng)。研究[11]表明,HIBD大部分神經(jīng)元死亡通過細胞凋亡途徑實現(xiàn),因此通過體外藥物干預(yù)阻止缺氧缺血周圍神經(jīng)元細胞凋亡,對HIBD的損傷和防治有重要意義。
Fas是腫瘤壞死因子受體和神經(jīng)生長因子受體家族的細胞表面分子,表達于多種細胞表面,相對分子質(zhì)量為40~50 kD的Ⅰ型跨膜蛋白,含有3個富含半胱氨酸的肽鏈,具有重要功能的細胞表面受體。FasL是一種相對分子質(zhì)量為40 kD的Ⅱ型跨膜蛋白,由281個氨基酸組成,F(xiàn)asL僅表達于活化的T細胞,與Fas結(jié)合后,進一步與細胞內(nèi)的死亡受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合,原凋亡信號首先活化Caspase啟始因子,使pro-Caspase-8活化為Caspase-8,效應(yīng)分子特異地水解細胞中的一系列底物,Caspase引發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)是細胞凋亡過程的中心環(huán)節(jié),導(dǎo)致細胞凋亡[12]。
本研究發(fā)現(xiàn),正常生理情況下,大鼠腦組織中的Fas/FasL相對表達量均維持在一個較低水平,以便維持機體正常更新分化的基礎(chǔ)狀態(tài)。在HIBD組大鼠腦組織中,F(xiàn)as/FasL基因和蛋白水平在6 h開始增加,基因水平在12 h達最高峰,并在24 h維持在較高水平,隨后開始下降;蛋白水平在6~24 h持續(xù)增加,并在24 h時達最大值。蛋白水平表達相對滯后于基因表達,這符合基因先轉(zhuǎn)錄后翻譯的規(guī)律。表明HIBD能明顯引起腦組織中的神經(jīng)元細胞凋亡,這一結(jié)果與文獻[13,14]報道結(jié)果相似。經(jīng)EPO干預(yù)治療后,無論在基因水平還是在蛋白水平,F(xiàn)as/FasL表達均低于HIBD組,表明EPO可通過減少Fas/FasL表達,阻斷Fas/FasL細胞受體死亡途徑,減少神經(jīng)元細胞的凋亡,從而保護腦神經(jīng)元細胞。
綜上所述,HIBD可通過基因水平和蛋白水平上調(diào)Fas/FasL表達,促進神經(jīng)元細胞凋亡,從而引起大鼠腦組織神經(jīng)元損傷,EPO可明顯減緩其對腦組織神經(jīng)元的傷害。
[1]Busl KM,Greer DM.Hypoxic-ischemic brain injury:pathophysiology,neuropathology and mechanisms[J].Neuro Rehabilitation,2010,26(1):5-13.
[2]Northington FJ,F(xiàn)erriero DM,Graham EM,et al.Early neurodegeneration after hypoxia-ischemia in neonatal rat is necrosis while delayed neuronal death is apoptosis[J].Neurobiol Dis,2001,8(2):207-219.
[3]Wang X,Zhang J,Si D,et al.Progesterone inhibits the expression of cycloxygenase-2 and interleukin-1β in neonatal rats with hypoxic ischemic brain damage[J].Int J Neurosci,2014,124(1):42-48.
[4]Iwai M,Stetler RA,Xing J,et al.Enhanced oligodendrogenesis and recovery of neurological function by erythropoietin after neonatal hypoxic/ischemic brain injury[J].Stroke,2010,41(5):1032-1037.
[5]裴雪梅,高然,張國英,等.促紅細胞生成素對新生兒缺氧缺血性腦病患兒血清NSE和S-100B的影響[J].中國當代兒科雜志,2014,16(7):705-708.
[6]Northington FJ,Chavez-Valdez R,Martin LJ.Neuronal cell death in neonatal hypoxia ischemia[J].Annal Neurol,2011,69(5):743-758.
[7]Jelkmann W.Physiology and pharmacology of erythropoietin[J].Transfus Med Hemother,2013,40(5):302-309.
[8]Jacobs K,Shoemaker C,Rudersdorf R,et al.Isolation and characterization of genomic and cDNA clones of human erythropoietin[J].Nature,1985,313(6005):806-810.
[9]Mammis A,McIntosh TK,Maniker AH.Erythropoietin as a neuroprotective agent in traumatic brain injury:review[J].Surgical Neurol,2009,71(5):527-531.
[10]谷金寧,李杰,王林全,等.EPO對癲癇大鼠心肌中JNKMAPK和 P38MAPK 表達的影響[J].山東醫(yī)藥,2010,50(9):26-27.
[11]Zhang XY,Yang YJ,Xu PR,et al.The role of β-catenin signaling pathway on proliferation of rats neural stem cells after hyperbaric oxygen therapy in vitro[J].Cell Mol Neurobiol,2011,31(1):101-109.
[12]Villa-Morales M,F(xiàn)ernández-Piqueras J.Targeting the Fas/FasL signaling pathway in cancer therapy[J].Expert Opin Ther Targets,2012,16(1):85-101.
[13]王偉,王軍,徐艷,等.缺血缺氧性新生大鼠皮層神經(jīng)元胞漿Smac/Diablo,caspase-9的表達及參附注射液的干預(yù)作用[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志,2011,10(3):228-231.
[14]祝大麗,朱萍,王瑞嬌,等.三七總皂甙對新生SD大鼠窒息致腦損傷后Bax表達影響的實驗研究[J].中國婦幼保健,2013,28(16):2608-2611.