蔡潮農，李堅，李培平，關曉東，張百萌，朱耿隆

(中山大學附屬第五醫(yī)院，廣東珠海519000)

Cohn和Fisher于上世紀50年代提出入肝門靜脈完全動脈化(PVA)，目的在于提高門腔分流術(PCS)后肝臟血流灌注及降低術后肝性腦病的發(fā)生率。之后陸續(xù)有學者建立了多種的PVA動物模型［1，2］，用于研究PCS后如何減少肝性腦病的發(fā)生、擴大的部分肝切除術后肝功能衰竭及異位輔助性肝移植術后肝功能衰竭的預防［3］。既往PVA研究多局限于正常大鼠，在肝硬化大鼠中研究較少，尚缺乏系統的實驗研究。研究［4～6］發(fā)現，PVA能改善正常大鼠和肝硬化大鼠的肝功能，并促進正常大鼠肝再生，但對肝硬化大鼠肝再生的影響尚不清楚。增殖細胞核抗原(PCNA)是反映細胞增殖狀態(tài)的良好指標。2013年11月～2014年3月，我們以肝硬化大鼠為對象，觀察PVA對肝硬化大鼠肝細胞PCNA表達的影響，旨在為PVA促進肝再生提供實驗證據。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級健康雄性SD大鼠110只，購自中山大學實驗動物中心，體質量(250±20)g。一抗為 PCNA(PC10 mAb，美國 Santa Cruz Biotechnology公司);二抗為Kit-0100M、Ultra Sensitive S-P Mouse(福州邁新生物技術開發(fā)有限公司);四氯化碳(CCl4)溶液由我院中心實驗室提供，DAB顯色液(福州邁新生物技術開發(fā)有限公司，DAB-2031加強型DAB Plus Kit)。實驗過程中對大鼠的處置按中華人民共和國科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》進行，符合動物倫理學管理要求。

1.2 肝硬化模型建立及分組方法 采用純CCl4溶液以食用花生油稀釋成60%的CCl4溶液，前4次及最后4次劑量為0.3 mL/100 g皮下注射，第5～11次注射劑量為 0.5 mL/100 g，1 次/4 d，前4次注射后間隔10 d注射第5次，之后4 d注射1次，共15次;每次注射時嚴格測量體質量;動物飼養(yǎng)造模期間飲含100 mL/L乙醇水溶液［7］。術前隨機抽出10只肝硬化大鼠作為對照組，不進行干預;其余大鼠隨機分為A組40只、B組40只、C 組 20 只，A 組參考文獻［4～6，8］方法行 PVA+PCS，利用大鼠右腎動脈、靜脈實現PVA及門腔分流。B組行入肝門靜脈離斷+PCS。C組予門靜脈阻斷30 min+右腎切除術，阻斷門靜脈時間依據A、B組動物阻斷門靜脈的平均時間。

1.3 肝細胞PCNA檢測 對照組1周后處死大鼠。術后1、2、4、8周每個時點 A、B 組分別處死10只，C組處死5只，取肝臟組織。肝組織標本固定充分后，石蠟包埋，連續(xù)4 μm厚切片。切片常規(guī)脫蠟后蒸餾水沖洗5 min;用3%過氧化氫孵育30 min以抑制內源性過氧化物酶;1%正常小牛血清孵育20 min封閉內源性過氧化酶;加PCNA一抗稀釋液(1∶50)4℃濕盒內室溫孵育過夜，PBS沖洗3次×5 min;加生物素標記的二抗室溫孵育30 min;加ABC復合物室溫作用30 min，PBS徹底沖洗;DAB顯色液染色2～10 min，蘇木素輕度復染;系列乙醇脫水，二甲苯透明;樹膠封片觀察。由兩名病理醫(yī)師雙盲法分別觀察免疫組織化學染色結果，在高倍鏡下(×400)隨機觀察4個視野共1 000個細胞，核內有棕黃色顆粒沉積者為陽性細胞。PCNA陽性表達細胞比例=陽性細胞數/觀察的細胞總數×100%。取其二人計數結果的平均值

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。計量資料以±s表示，組間各時點比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗;術后各時點與術前比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

A組術后各時點PCNA陽性表達細胞比例均高于對照組(P均＜0.01)，B、C組術后各時點PCNA陽性表達細胞比例均低于對照組(P均＜0.01)。A組術后各時點PCNA陽性表達細胞比例均高于B、C組(P均＜0.01)。見表1。

表1 各組不同時點肝細胞PCNA陽性表達細胞比例比較(%，±s)

表1 各組不同時點肝細胞PCNA陽性表達細胞比例比較(%，±s)

注:與對照組相比，*P ＜0.01;與 A組同時點相比，△P ＜0.01。

組別PCNA 陽性表達細胞比例術后1周 術后2周 術后4周 術后8周A 組 76.1 ±5.50* 68.7 ±7.65* 20.4 ±4.74* 15.2 ±4.02*B 組 5.1±2.33＊△ 3.1 ±1.52＊△ 2.8 ±1.32＊△ 3.2±1.55＊△C 組 4.6±2.07＊△ 2.6 ±1.14＊△ 3.0 ±1.58＊△ 2.6±1.14＊△對照組10.9 ±2.33 10.9 ±2.33 10.9 ±2.33 10.9 ±2.33

3 討論

肝臟有肝動脈及門靜脈雙重血供，血流豐富，約75%的血液來自門靜脈。以往認為，門靜脈血中的肝臟營養(yǎng)因子對肝細胞的再生必不可少。1952年，Cohn等最早提出用動脈血代替門靜脈血灌注肝臟的設想，后續(xù)的實驗證明，以適當壓力和流量的動脈血灌注肝臟，可使分流后的動物維持正常肝血流量，促進肝細胞增殖，保證肝臟的正常解毒功能。研究［9～11］發(fā)現，不論是在正常或梗阻性黃疸后再通的大鼠，還是在同時行PVA的大鼠，肝臟部分切除后術后肝質量的測定、有絲分裂期肝細胞的計數和流式細胞儀對各期DNA含量的檢測均表明肝細胞再生非常明顯且相似，提示PVA后同樣可明顯促進肝臟再生，門靜脈血的供應對肝臟的再生并非必要條件。李堅等［5］在正常大鼠肝臟部分切除后進行了類似實驗，證實PVA后可促進正常大鼠及肝臟部分切除大鼠肝細胞增殖。但在肝硬化大鼠，PVA是否同樣促進肝細胞增殖，目前類似的研究甚少。

PCNA是一種相對分子質量為36 kD的蛋白質，在細胞核內合成，并存在于細胞核內，為DNA聚合酶δ的輔助蛋白，與細胞DNA合成關系密切，在細胞增殖的啟動上起重要作用，是反映細胞增殖狀態(tài)的良好指標［12］。本課題按入肝血流量變化情況，將A組歸為富血、富氧，B組歸為缺血、缺氧，C組及對照組歸為基本不變;從肝細胞PCNA表達變化情況分析發(fā)現，PVA后富氧的入肝血流灌注，可有效促進肝細胞PCNA表達，提示PVA可促進肝硬化大鼠肝細胞增殖。我們前期研究發(fā)現，PVA能明顯改善肝硬化大鼠肝功能及儲備功能［6，13］。PVA后肝硬化大鼠肝細胞增殖活躍，這可能是PVA后肝硬化大鼠肝功能改善的細胞學基礎。

PVA促進肝硬化大鼠肝臟再生，主要機制是通過動脈血強化灌注門靜脈，增加門靜脈的壓力和改善肝臟缺血缺氧，加速線粒體能量代謝功能恢復，提高三磷酸腺苷產能。肝細胞主要由線粒體的呼吸鏈供能，其作用約消耗肝臟90%的供氧，而肝細胞再生的啟動有賴于白細胞介素6及腫瘤壞死因子α等因子表達的增加［14］。充足的肝血流量是肝細胞增殖的前提因素，在門靜脈血流量相同的情況下，靜脈血和動脈血均能有效啟動及維持肝臟的正常再生能力［15］。本實驗在肝硬化大鼠模型上的類似結果，說明PVA能有效促進肝硬化大鼠肝細胞核表達PCNA，提示該技術有助于肝硬化大鼠肝細胞再生，這對PVA技術在肝硬化門靜脈高壓癥的治療上有重要意義。

綜上所述，PVA能有效促進肝硬化大鼠肝細胞PCNA表達，促進肝臟再生，其可能通過增加肝臟灌注和改善肝細胞氧供起作用。

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