劉備，唐冬梅，杜寧，徐桂萍

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，石河子832000;2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院)

肺缺血再灌注損傷(IRI)多發(fā)生于肺移植、失血性休克、體外循環(huán)后，IRI發(fā)生時(shí)，肺組織缺血后的再灌注不僅不能使肺功能恢復(fù)，反而可加重肺功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷，并最終發(fā)展為急性肺損傷(ALI)或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)［1］。肺移植時(shí)，IRI發(fā)生率高達(dá)25%［2］。IRI機(jī)制較多，其中氧自由基及炎癥反應(yīng)等是主要因素［3］。七氟烷是臨床常用吸入麻醉藥，具有血?dú)夥峙湎禂?shù)低、誘導(dǎo)蘇醒快、血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。有學(xué)者已證明七氟烷對(duì)急性肺損傷的保護(hù)作用優(yōu)于其他吸入麻醉藥［4］，且該種保護(hù)作用與減輕脂質(zhì)過(guò)氧化、減少炎癥介質(zhì)釋放有關(guān)［5］。本研究在建立IRI大鼠基礎(chǔ)上，擬探討七氟烷預(yù)處理聯(lián)合后處理對(duì)IRI大鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的成年雄性SD大鼠54只，體質(zhì)量300～350 g。七氟烷(Maruishi Pharmaceutical公司)，TNF-α 測(cè)定試劑盒(北京永輝生物科技有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thremo公司)，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。小動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司)。凝膠圖像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國(guó))。

1.2 IRI模型制作及動(dòng)物分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將54只SD大鼠分為假手術(shù)組(S組)、肺缺血再灌注組(I/R組)和七氟烷預(yù)處理聯(lián)合后處理組(SP組)各18只。參照文獻(xiàn)［6］采用Epinger方法制備IRI模型。腹腔注射20%烏拉坦4 mL/kg進(jìn)行麻醉，仰臥位固定;游離頸內(nèi)靜脈，行頸內(nèi)靜脈穿刺并置管，持續(xù)輸注生理鹽水;游離氣管，行氣管切開(kāi)并插管，接小動(dòng)物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣，通氣頻率65～70次/min，潮氣量10～15 mL/kg，呼吸比1.0∶1.5。呼吸機(jī)的進(jìn)氣口與裝有七氟烷揮發(fā)罐的麻醉機(jī)呼吸回路末端相連。通氣30 min后，將大鼠改為右側(cè)臥位，左側(cè)第5肋間入胸，離斷左下肺韌帶，游離左肺門(mén)，經(jīng)由頸內(nèi)靜脈三通處注射50 U肝素，5 min后，于呼氣末采用無(wú)創(chuàng)血管夾夾閉左肺門(mén)(包括左主支氣管、左肺動(dòng)、靜脈)，通氣時(shí)肺組織不再膨脹，顏色由淡紅變?yōu)榘底霞t色，表明阻斷成功。阻斷45 min后松開(kāi)血管鉗恢復(fù)血液循環(huán)和通氣形成再灌注，觀察5 min內(nèi)肺組織膨脹，顏色逐漸恢復(fù)，表明再灌注成功。S組僅游離左肺門(mén)，不阻斷;I/R組按上述方法制備IRI模型;SP組吸入2.1%七氟烷30 min后，停止吸入洗脫10 min，然后阻斷左肺門(mén)45 min，并于松開(kāi)血管夾即刻再次吸入2.1%七氟烷30 min制備IRI模型。

1.3 觀察指標(biāo)及方法 ①血漿SOD活性。分別于再灌注30、60、120 min時(shí)各組隨機(jī)取6只大鼠，做死亡心臟采血，吸取血液2 mL加入含肝素溶液的試管中，3 000 r/min離心20 min后取上清，采用比色法檢測(cè)SOD活性。②肺組織中TNF-α表達(dá)。分別于再灌注30、60、120 min時(shí)各組隨機(jī)取6只大鼠處死，取部分肺組織，采用ELISA法測(cè)定TNF-α。③肺組織濕/干質(zhì)量比(W/D比)。切取大鼠部分肺組織，生理鹽水沖干肺上血跡，濾紙吸干表面水分，稱(chēng)得濕質(zhì)量(W值)后將該肺組織置于風(fēng)箱中12 h至橫重，稱(chēng)得干質(zhì)量(D值)，二者相比得W/D值。④血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)mRNA表達(dá)。取部分－80℃冰箱保存的左肺組織，采用TRIzol法處理、分離、RNA沉淀、RNA洗滌、RNA溶解提取總RNA，并測(cè)定其濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成反轉(zhuǎn)錄cDNA，然后進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。取所得PCR產(chǎn)物5 μL點(diǎn)樣于2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，用凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描測(cè)定PCR擴(kuò)增條帶的吸光度值，以ACE mRNA條帶吸光度值與β-actin條帶吸光度值的比值表示ACE mRNA水平。⑤肺組織病理學(xué)改變。取出部分左肺組織，10%中性甲醛固定過(guò)夜，脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片(厚4 μm)，HE染色，100倍光鏡下觀察病理學(xué)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間及組內(nèi)比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肺組織W/D、TNF-α 表達(dá)、ACE mRNA表達(dá)及血漿SOD活性比較 三組大鼠各個(gè)時(shí)點(diǎn)肺組織W/D、TNF-α表達(dá)、ACE mRNA表達(dá)及血漿SOD活性水平的比較見(jiàn)表1。

2.2 各組肺組織病理學(xué)結(jié)果比較 光鏡下，S組肺組織未見(jiàn)明顯異常。I/R組肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)大量紅細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且I/R組120 min組織破壞最為嚴(yán)重，SP組肺組織病理學(xué)損傷較I/R組輕。

表1 三組不同時(shí)點(diǎn)肺組織中W/D、TNF-α、ACE mRNA表達(dá)及血漿SOD活性水平比較(n=6，±s)

表1 三組不同時(shí)點(diǎn)肺組織中W/D、TNF-α、ACE mRNA表達(dá)及血漿SOD活性水平比較(n=6，±s)

注:與同組再灌注30 min時(shí)相比，*P＜0.05;與同組再灌注60 min時(shí)相比，ΔP＜0.05;與S組同時(shí)間點(diǎn)相比，○P＜0.05;與I/R組同時(shí)間點(diǎn)相比，□P ＜0.05。

組別 W/D SOD(U/mgprot) TNF-α(pg/mg)ACE mRNA S 組再灌注 30 min 4.529 ±0.169 33.27 ±2.85 43.03 ± 3.93 0.36 ±0.08再灌注 60 min 4.384 ±0.282* 36.42 ±2.45* 48.83 ± 4.82* 0.40 ±0.06*再灌注120 min 4.583±0.264*Δ 34.38±2.28*Δ 49.80± 3.87*Δ 0.43±0.09*Δ I/R組再灌注30 min 5.007 ±0.151○ 24.28±1.34○ 219.19 ±14.15○ 0.70±0.09○再灌注60 min 5.180±0.101＊○ 21.03±1.72＊○ 253.73±15.47＊○ 0.82±0.07＊○再灌注120 min 5.534 ±0.201*Δ○ 18.18±1.42*Δ○ 299.67 ±16.61*Δ○ 0.92±0.04*Δ○SP組再灌注30 min 4.736±0.141○□ 28.15±1.63 ○□ 150.18± 4.67○□ 0.49±0.08○□再灌注60 min 4.957±0.166＊○□ 26.78±1.25＊○□ 167.68± 4.64＊○□ 0.66±0.05＊○□再灌注120 min 5.307 ±0.107*Δ○□ 23.49 ±1.60*Δ○□ 189.25 ± 4.35*Δ○□ 0.77 ±0.04*Δ○□

3 討論

IRI時(shí)肺內(nèi)氧自由基大量生成，致使肺脂質(zhì)過(guò)氧化，造成肺內(nèi)毛細(xì)血管及氣道損傷［7］;與此同時(shí)，這種損傷促使肺內(nèi)炎癥介質(zhì)釋放，激活I(lǐng)RI的炎癥反應(yīng)［8］。

SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，在IRI過(guò)程中可抑制肺脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減少氧自由基損害。Yang等［9］研究證實(shí)缺血再灌注開(kāi)始即刻便有大量活性氧物質(zhì)生成，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)中I/R組較S組各時(shí)點(diǎn)SOD活性降低，證實(shí)了以上觀點(diǎn);而經(jīng)由七氟烷聯(lián)合處理后，SP組較I/R組各時(shí)點(diǎn)SOD活性均升高，表明七氟烷聯(lián)合處理后肺內(nèi)SOD活性增加，氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕。

目前，IRI的詳細(xì)機(jī)制尚未明了，其特征性病理變化為肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損后，肺泡—毛細(xì)血管屏障功能障礙，使炎癥細(xì)胞和炎性介質(zhì)滲出，肺泡及肺泡間質(zhì)水腫，組織細(xì)胞死亡［10］。肺組織中含有豐富的ACE，ACE mRNA表達(dá)上調(diào)可促使AngⅡ產(chǎn)生，同時(shí)伴有少量TNF-α的生成，進(jìn)而激活炎癥反應(yīng)［11］。W/D比則可通過(guò)肺微血管損傷情況反映IRI程度，本實(shí)驗(yàn)中，光鏡下I/R組較S組肺組織破壞嚴(yán)重，且肺組織W/D、TNF-α及ACE mRNA表達(dá)水平均升高，提示ACE mRNA及TNF-α表達(dá)可使毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，造成肺泡間隔水腫增寬。隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，肺組織損傷逐漸加重，I/R組120 min組織破壞最為嚴(yán)重，表明IRI具有時(shí)間相關(guān)性。七氟烷聯(lián)合處理后，SP組較I/R組肺組織W/D、TNF-α及ACE mRNA表達(dá)水平均降低，表明七氟烷聯(lián)合處理可通過(guò)抑制肺內(nèi)ACE mRNA及TNF-α表達(dá)，減輕IRI的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮肺保護(hù)作用。

綜上所述，七氟烷預(yù)處理聯(lián)合后處理可能通過(guò)抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)對(duì)IRI大鼠發(fā)揮保護(hù)作用。

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