■湯海鷗 高秀華 姚 斌 張廣民 王振興 孔祥書

（1.中國農業(yè)科學院飼料研究所農業(yè)部飼料生物技術重點實驗室，北京 100081；2.生物飼料開發(fā)國家工程研究中心，北京 100081；3.河南省黃泛區(qū)鑫欣牧業(yè)有限公司，河南黃泛區(qū) 466632）

外界環(huán)境的變化及攝入食物可能影響動物腸道中微生物菌群的平衡，造成有害菌群生長和腹瀉等消化道疾病，引起畜禽類動物消化道疾病常見的病源微生物主要有大腸桿菌和沙門氏菌等。傳統(tǒng)預防胃腸道疾病多以在飼料中添加抗生素類藥物，抗菌藥在動物上的長期大量使用，易引起機體胃腸功能紊亂，使耐藥菌株增加。因此，世界各國都開展著對抗生素替代物的研究。葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GOD）是一種能夠催化葡萄糖被分子氧或原子氧氧化為葡萄糖酸內酯和過氧化氫的氧化還原酶，其中葡萄糖酸內酯可以自發(fā)水解成為葡萄糖酸，具有類似酸化劑的作用，過氧化氫具有廣譜殺菌作用，可以起到抑制大腸桿菌、沙門氏菌等致病微生物生長繁殖的作用[1-2]，1999年GOD就已被列入農業(yè)部飼料添加劑品種目錄中規(guī)定可以添加使用的飼用酶制劑之一，本實驗室通過基因克隆技術在畢赤酵母生物反應器中進行高效表達，采用液體深層發(fā)酵方式使GOD酶活水平達到了615 U/ml，大大降低了生產成本[3]。前期試驗研究表明，GOD能有效地改善單胃動物胃腸道健康，提高畜禽的生長性能[4-5]。然而，GOD在動物生產上發(fā)揮效果的具體抑菌、產酸功能，并未見有具體的體外驗證試驗文獻報道。鑒于此，本試驗通過單層平板擴散試驗和pH值測定試驗研究GOD對大腸桿菌、沙門氏菌的體外抑菌效果和產酸能力，探討GOD在動物生產上發(fā)揮效果的作用機理，為GOD在畜牧業(yè)上的廣泛應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗酶菌

試驗用飼用葡萄糖氧化酶產品由農業(yè)部飼料生物技術重點實驗室提供，酶活含量大于1 000 U/g（酶活定義為：在37℃、pH值為5.5的條件下，每分鐘內從過量底物中降解釋放1 μmol產物所需的酶量定義為1個酶活力單位，即1 U）；致病性大腸桿菌、沙門氏菌購自于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 試驗儀器

BCL-1360A型潔凈工作臺，北京亞泰科隆儀器技術有限公司；LDZX-50型高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；DNP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司；DGP-9057B-2型培養(yǎng)箱/干燥箱，上海?，攲嶒炘O備有限公司；HZQ-X100型振蕩培養(yǎng)箱，太倉市實驗設備廠；150 mm型游標卡尺，上海力成五金工具有限公司；FE20型實驗pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 溶液、培養(yǎng)基及配制方法

1.2.1 營養(yǎng)瓊脂配制

蛋白胨 1.0 g、酵母粉 0.5 g、NaCl 0.9 g、瓊脂粉1.5 g，加蒸餾水100 ml，混勻并充分溶解，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻到55℃左右傾注平皿，待培養(yǎng)基凝固后倒置，置37℃培養(yǎng)箱過夜進行無菌檢驗，合格后置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。營養(yǎng)肉湯成分相同，只是不加瓊脂粉，分裝到試管后再進行滅菌。

1.2.2 底物葡萄糖溶液（GS）

根據需要，取不同量葡萄糖，溶于去離子水，定容至100 ml，搖勻后即可使用。

1.2.3 乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（0.1 mol/l，pH值5.5）

稱取三水乙酸鈉11.57 g，加入冰乙酸0.85 ml。再加水溶解，定容至1 000 ml，測定溶液的pH值。如果pH值偏離5.5，再用乙酸溶液或乙酸鈉溶液（0.1 mol/l乙酸溶液：吸取冰乙酸0.60 ml，加水溶解，定容至100 ml；0.1 mol/l乙酸鈉溶液：稱取三水乙酸鈉1.36 g。加水溶解，定容至100 ml）調節(jié)至5.5。

1.2.4 生理鹽水

取NaCl 9.0 g，加蒸餾水1 000 ml，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后冷卻待用。

1.3 抑菌、產酸試驗操作方法

1.3.1 不同濃度葡萄糖溶液和GOD溶液抑菌試驗方法

用滅菌水配制成含有葡萄糖0、0.062 5、0.125、0.25 g/ml的溶液，用滅菌乙酸鹽緩沖液（pH值5.5）配制成含GOD 0、12.5、25、50 U/ml的溶液，分別采用牛津杯抑菌試驗方法，在牛津杯中加入試驗溶液270 μl，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，以抑菌圈清晰為好，測定抑菌圈直徑，以毫米（mm）為單位。每個樣品做3平行板。以下同。

1.3.2 牛津杯大腸桿菌抑菌試驗操作方法

將培養(yǎng)好的大腸桿菌用無菌生理鹽水稀釋成濃度約為107CFU/ml的菌液，吸取100 μl涂布于制備好的營養(yǎng)瓊脂平板上，然后再等距離地放置滅菌好的牛津杯，靜置5 min。取配置好的50 U/ml GOD 1.0 ml與0.1 g/ml（10%）GS 1.0 ml等體積混合，混合液再用滅菌乙酸緩沖液（pH值5.5）稀釋成含GOD 25、12.5、6.25、3.125 U/ml的溶液，37 ℃反應10 min后，取混合溶液270 μl加入牛津杯。

1.3.3 不同溫度處理下GOD抑制大腸桿菌試驗方法

分別取10.0 g GOD樣品置于不同溫度干熱處理10 min，然后將處理過的GOD取適量全部配制成GOD濃度為50 U/ml的溶液，將50 U/ml的GOD 1.0 ml與0.09 g/ml（0.5 mol/l）GS 1.0 ml等體積混合，混合液含GOD 25 U/ml，37 ℃反應10 min后，采用“1.3.2”牛津杯抑菌試驗方法，取混合溶液270 μl加入牛津杯。

1.3.4 牛津杯沙門氏菌抑菌試驗操作方法

將培養(yǎng)好的沙門氏菌用無菌生理鹽水稀釋成濃度約為107CFU/ml的菌液，吸取100 μl涂布于制備好的營養(yǎng)瓊脂平板上，然后再等距離地放置上滅菌的牛津杯，靜置5 min。取粉末型GOD 1.0 g溶解于100 ml滅菌乙酸鹽緩沖液中，GOD濃度為10 U/ml，然后用滅菌乙酸緩沖液分別稀釋成含GOD 5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 U/ml的溶液，6種濃度的酶液分別取1.0 ml酶液與0.1 g/ml（10%）GS 1.0 ml等體積混合，混合液GOD濃度則相應稀釋為5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 U/ml，37 ℃反應10 min后，取混合溶液270 μl加入牛津杯，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，以抑菌圈清晰為好，測定抑菌圈直徑。每個樣品做3平行板。

1.3.5 GOD體外產酸試驗操作方法

用FE20型實驗pH計測定初始配制好的葡萄糖溶液pH值，記為起始值。加入適量GOD樣品后，置于恒溫振蕩箱39℃、150 r/min振蕩。0.2 g GOD加入100 ml 20%（0.2 g/ml）GS溶液中，溶液中GOD酶活為1.0 U/ml。每隔1 h測量溶液pH值。每個樣品做3平行。

1.4 數據統(tǒng)計與分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，應用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行差異顯著性分析，采用LSD法進行多重比較，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果

2.1 GOD對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌結果

試驗結果表明，分別加入不同濃度葡萄糖或GOD溶液的結果表明所有試驗樣品都未見抑菌圈。

不同濃度和溫度處理下，GOD混合液抑制大腸桿菌和沙門氏菌試驗結果如表2、3、4。隨著GOD濃度的逐倍降低，對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌圈直徑相應也逐漸變小，且有些濃度之間出現顯著性差異（P＜0.05）。在65℃溫度處理下的GOD對大腸桿菌抑菌圈與常溫對照組未出現顯著性差異（P＞0.05），但在高于65℃條件下抑菌圈結果隨著溫度升高出現逐步降低的趨勢，高溫影響了GOD的抑菌效果，且65℃與75℃之間有顯著性差異（P＜0.05）。

表2 不同濃度GOD混合液對大腸桿菌抑菌試驗結果

表3 不同溫度處理GOD對大腸桿菌抑菌試驗結果

表4 不同濃度GOD混合液對沙門氏菌抑菌試驗結果

2.2 GOD體外產酸對pH值的影響（見表5）

表5 GOD混合液隨時間pH值變化結果

由表5可知，隨著時間的變長，GOD產酸效果越明顯，pH值從最初的5.61降低到3.03，呈逐漸降低趨勢，且部分結果之間有顯著性差異（P＜0.05）。

3 討論

大腸桿菌和沙門氏菌都是動物腸道中常見的有害菌，GOD在以葡萄糖為底物進行反應的過程中，一方面通過與葡萄糖作用而產生的葡萄糖酸來發(fā)揮降低pH值作用，酸性環(huán)境有利于乳酸桿菌等有益菌的生長繁殖，對大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌有抑制作用。黃建華等[6]研究了二甲酸鉀對斷奶仔豬大腸桿菌和乳酸桿菌的影響，結果表明二甲酸鉀添加降低了斷奶仔豬新鮮糞樣中大腸桿菌數。另一方面，反應產生的少量過氧化氫能起到抑菌殺菌的作用，動物上的應用可有效改善消化道健康。楊久仙等[7]研究GOD對斷奶仔豬胃腸道微生物區(qū)系以及生產性能的影響，結果顯示與對照相比，飼糧中添加GOD提高了仔豬日增重，降低了消化道內大腸桿菌數量。GOD在反應過程中同時會消耗氧氣，更易形成厭氧環(huán)境，大多數的有益菌是厭氧菌、有害菌是需氧菌，厭氧環(huán)境的形成更利于抑制腸道有害菌，促進有益菌的生長。筆者早期研究表明[5]，飼糧中添加GOD使仔豬糞便中沙門氏菌數顯著低于對照組。從本試驗結果可知，葡萄糖或者GOD在無底物葡萄糖存在的情況下瓊脂板上無抑菌圈產生，只有當添加有底物葡萄糖時GOD才能發(fā)揮有效的抑菌效果。GOD對大腸桿菌和沙門氏菌抑菌圈直徑都大于常用抗菌藥物敏感性試驗敏感度抑菌圈最低值（10～12 mm），這說明GOD對動物腸道內常見的大腸桿菌和沙門氏菌有較好的抑菌效果。GOD的產酸效果對pH值起到了很大降低作用。

4 結論

不同濃度和溫度處理下，GOD混合液對大腸桿菌和沙門氏菌有較好的抑制效果；隨著時間的變長，GOD產酸效果越明顯。