■計 成 趙麗紅 李笑櫻 劉淑靜

（中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院動物營養(yǎng)國家重點實驗室，北京 100193)

科技的進步推動了人類社會的全面發(fā)展，農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)的發(fā)展使人們在滿足物質生活的同時，越來越多地關心畜產(chǎn)品和食品的質量和安全。諸如瘦肉精、三聚氰胺、牛奶黃曲霉毒素M1超標事件的發(fā)生，使人們更加警示和關注畜產(chǎn)品安全問題。全球飼料霉菌毒素污染具有普遍性和嚴重性，隨時隨地危害畜禽生產(chǎn)和人類食品安全。美國早在2002年已將霉菌毒素列為對人類食物鏈造成巨大威脅的危險因素，其毒性僅次于二噁英。谷物糧食等作物在田間就會感染霉菌，如果環(huán)境溫度、濕度適合，在運輸、加工、儲存過程中霉菌會繼續(xù)繁殖生長，毒素含量相應會繼續(xù)增加。飼料霉變給糧食工業(yè)和畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）估計，全球每年25%的谷物受到霉菌毒素的污染，平均有2%不能食用造成浪費；加之因采食霉變飼料引起的動物中毒、疾病和死亡，造成的危害和損失數(shù)據(jù)難以統(tǒng)計。

1 嘔吐毒素污染概況

谷物飼料易受鐮孢菌、頭孢霉、漆斑菌和其它一些霉菌污染，所產(chǎn)生的鐮孢霉毒素對人類和動物健康有極大的危害[1]。鐮孢霉毒素中最重要、數(shù)量最多的毒素是單端孢霉烯類毒素（Trichothecenes,TS），該類毒素包括約150種化合物，大致劃分為A類、B類等四個亞類。A類單端孢霉烯毒素包括：T-2毒素、HT-2毒素、雙乙酸基藨草烯醇（DAS）和鐮孢菌酸（NEO）；B類單端孢霉烯毒素包括：脫氧瓜萎鐮孢菌烯醇（又名嘔吐毒素,DON）、雪腐鐮孢菌烯醇（NIV）和鐮孢菌烯酮-X等[2]。

嘔吐毒素對谷物的污染程度居于鐮刀菌毒素之首，對動物健康造成巨大威脅。嘔吐毒素的化學名稱為3α,4β,7α,15-四羥墓蔗草鐮孢菌-9-烯-8-酮，分子式為C15H20O6，分子量為296.3，多分布于小麥、大麥、玉米等谷物籽實中[3]。加拿大小麥中嘔吐毒素的含量高達8.5 mg/kg，南非玉米嘔吐毒素的含量高達160 mg/kg，埃及有50%的谷物中有嘔吐毒素，含量為0.07～4.0 mg/kg。中國配合飼料樣品中嘔吐毒素陽性檢出率高達100%，平均含量為0.6 mg/kg。飼料或糧食中DON含量超過1 mg/kg時會對人和動物健康產(chǎn)生危害，因此，美國食品藥物管理局規(guī)定食品中DON限量標準為1 mg/kg，我國農(nóng)業(yè)部也對動物飼料中DON的限量標準做了規(guī)定，其值也不應超過1 mg/kg[4]。課題組2011年對北京市15個代表性養(yǎng)豬場所用飼料原料和全價配合飼料（131份）霉菌毒素污染情況、檢出頻率和特點進行調研，結果表明：玉米、麩皮、豆粕、DDGS和配合飼料中各類霉菌毒素的檢出率都非常高，其中玉米、DDGS和部分全價配合飼料所含毒素超標率很高，而嘔吐毒素的超標率最高，玉米嘔吐毒素超標率為57.1%，DDGS超標率為88.2%，豬配合飼料嘔吐毒素超標率為15.8%[5]。

2 動物嘔吐毒素中毒癥及毒理作用機制

不同動物對DON的敏感性不同，豬對其最敏感，牛、羊次之，家禽對DON有較高的耐受力。豬DON最明顯的中毒特征為：嘔吐、拒食、腹痛、腹瀉，解剖發(fā)現(xiàn)胃腸道炎癥、出血等癥狀，長時間采食DON可延緩豬的生長、降低免疫機能[6]。家禽DON中毒癥：采食量和增重下降，解剖發(fā)現(xiàn)口腔潰瘍，肌胃糜爛，死亡率升高。牛DON中毒表現(xiàn)：體質衰弱，采食量下降，生長緩慢，產(chǎn)奶量降低，受孕率低。據(jù)Danicke（2002）[7]報道，豬日糧中DON含量在1 mg/kg、犢牛2 mg/kg、家禽5 mg/kg，即可影響其采食量和增重。豬的日糧中DON含量達2 mg/kg時，24 h后常出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、肌無力，甚至昏迷。DON對人類健康的危害研究已經(jīng)證明，發(fā)霉玉米中的DON對人產(chǎn)生食物中毒性白細胞缺乏癥（ATA）。人的中毒癥狀主要表現(xiàn)為胃部不適，惡心、嘔吐、頭痛、頭暈、腹痛、腹瀉等。有資料顯示，曾在前蘇聯(lián)、中國及北美等國家和地區(qū)爆發(fā)過人類食物中毒性白細胞缺乏癥病，發(fā)病率和死亡率均較高。在我國食管癌、胃癌高發(fā)區(qū)居民飲食中DON污染率和含量均相當高。國際癌癥研究機構（IARC）已將嘔吐毒素列為三類致癌物之一。

嘔吐毒素的毒性基團是C12,13-環(huán)氧基，該毒性基團對生長較快的細胞（胃腸道黏膜細胞、淋巴細胞、脾細胞、胸腺細胞等）有較強的損傷作用，而且還抑制蛋白質的合成。DON的毒理作用機制可總結為：DON在代謝過程中，第9位分子官能團由羥基生成了酯類，再與細胞核糖體結合，通過切斷某些肽鍵和肽鏈而破壞核糖體功能結構，干擾位于核糖體60S亞基上的肽基轉移酶活性中心，最終抑制蛋白質的合成[8]。當DON進入細胞后，強烈地與核糖體結合，并給雙鏈RNA蛋白激酶（PKR）和造血細胞激酶（HcK）轉導信號；同時，核糖體的中毒性應激反應使p38和細胞外調節(jié)蛋白激酶（ERK）活性降低，抑癌基因p53和轉錄因子c-Jun磷酸化被誘導，進一步使絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化，激活體內(nèi)MAPKs信號通路，從而引起機體各種生理反應[9]。其信號傳導的具體機制尚不很清楚，兩種假說，一種可能是由蛋白質介導的，一種可能是由于DON損害了28S rRNA基因造成的。

真核生物體內(nèi)MAPKs鏈是信號傳遞網(wǎng)絡中的重要途徑，在將細胞外刺激信號轉導至細胞及其核內(nèi)，并引起細胞生物學反應的過程中起到至關重要的作用。目前已發(fā)現(xiàn)3條并行的MAPKs信號通路（ERK、JNK/SAPK和p38）參與了DON激活的MAPK過程[10]。當ERK、JNK/SAPK和p38接受上游的級聯(lián)反應信號后，不僅可以磷酸化胞漿蛋白，而且可以轉位進入細胞核，磷酸化一些核內(nèi)的轉錄因子（c-fos、c-Jun、Elk-1、c-myc 和ATF-2），使下游一系列致炎細胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）大量表達[11-12]，從而參與細胞增殖與分化的調控。

最近研究表明，DON還可引起線粒體細胞凋亡基因Bax的易位和細胞色素C的釋放。DON引起線粒體細胞色素C釋放，激活caspase-9凋亡啟動分子，再激活caspase-3凋亡作用分子，引起細胞凋亡[13-14]。不僅如此，DON還可使線粒體跨膜能力下降，釋放大量的O2-·，導致線粒體膜兩側的離子失去平衡，線粒體外膜發(fā)生破裂，以改變線粒體膜通透性轉換孔道（PTP）的開閉狀態(tài)的方式介導細胞凋亡[15]。

3 嘔吐毒素解毒、去毒方法

嘔吐毒素對畜牧業(yè)及人類產(chǎn)生如此嚴重的危害，因此，如何實現(xiàn)該類毒素的解毒、去毒是畜牧工作者研究的重要課題。迄今為止，已知的去除飼料中嘔吐毒素的方法有物理、化學和生物學法。

物理去毒方法包括研磨，密度篩選，使用紫外光、γ-射線照射以及添加霉菌毒素吸附劑等。嘔吐毒素能溶于水，將受其污染的谷物濕磨碎后，嘔吐毒素會在浸漬液中富集，淀粉中只含有少量毒素。谷物和油料籽實的密度篩選法是根據(jù)受污染和不受污染谷物籽實的密度差異，采用浮選法將它們重新分流，從而將二者區(qū)分開來的方法，這種方法能夠顯著降低嘔吐毒素的濃度。易感染嘔吐毒素的玉米和小麥很適用于這種方法。目前，應用較廣的物理去毒方法是霉菌毒素吸附劑法，包括硅藻土、黏土、硅鋁酸鹽、酵母細胞壁提取物、酯化甘露聚糖、葡甘露聚糖等。但大量試驗證實霉菌毒素吸附劑只對飼料中的黃曲霉毒素（AFB）有較好的吸附效果（大約能吸附70%左右的AFB1），而對DON的吸附率不足5%。因此，目前對于飼料DON的去除沒有更好的解決方法。

上述諸多物理、化學脫毒方法因其具有不可避免的缺陷，如飼料經(jīng)化學脫毒處理后營養(yǎng)品質和適口性降低，吸附劑吸附法只對黃曲霉毒素有吸附效果，對其他毒素無效，吸附毒素同時還吸附維生素和礦物元素，因此對養(yǎng)殖者來說都不太適用，沒有被廣泛應用。生物降解法因其具有高效性、環(huán)保性而成為人們關注的熱點。

4 嘔吐毒素生物降解研究進展

微生物降解是目前對嘔吐毒素污染削減研究的重點。有研究表明，DON結構中C12和C13位的環(huán)氧結構和C3-OH基團是DON的主要毒性基團，也是生物降解主要研究位點(見圖1)。

4.1 開環(huán)氧化作用

20世紀70年代，Sato等[16]報道植物中的硫醇類物質對C12和C13位環(huán)氧結構具有親核攻擊作用，還原劑破壞環(huán)氧結構后生成烯烴，水解后生成兩個相鄰的-OH基團。Yoshizawa等[17-18]報道，動物腸道中的細菌可以將DON中的C12和C13環(huán)氧結構降解為C9和C12形成雙鍵的物質。同時，研究證明牛瘤胃和腸道中的混合微生物可將單端孢霉烯中的環(huán)氧結構破壞，但瘤胃和腸道中的純培養(yǎng)物對DON的環(huán)氧結構沒有作用，可能是這些細菌嚴格厭氧，具有復雜的營養(yǎng)需求。Binder等[19]從牛瘤胃的富集培養(yǎng)物中分離到一株可轉化DON和其他單端孢霉烯族毒素的厭氧優(yōu)桿菌屬細菌（Eubacterium BBSH797），隨后的試驗確定了菌株BBSH797降解DON的代謝產(chǎn)物為DOM-1[20]。He等[21]從雞腸道中分離篩選出微生物可將98%以上的DON在96 h內(nèi)轉化為DOM-1。Eriksen等[6]通過毒性試驗研究發(fā)現(xiàn)，DOM-1的毒性遠遠低于DON，為DON的1/55。Yu等[22]采用PCR-DG?GE方法從雞腸道中分離了10株具有將DON轉化為DOM-1的菌株。Guan等[23]從褐色大頭鯰腸道中分離得到微生物混合物C133，該混合物在完全培養(yǎng)基中將DON轉變?yōu)镈OM-1。Li等[24]通過仔豬飼喂試驗發(fā)現(xiàn)菌株LS100具有將DON轉化為DOM-1的能力，且降解產(chǎn)物DOM-1不會對豬產(chǎn)生負面影響。

圖1 DON推測的作用位點

4.2 3C-糖苷化、異構化和氧化作用

3C-糖苷化作用是微生物產(chǎn)生的糖苷酶或者乙?；D移酶將葡萄糖基或者乙?；D移到DON的3號位碳原子上，生成毒性比DON低的降解產(chǎn)物DON-葡糖苷酸或者3-ADON，據(jù)推測正是由于乙酰基轉移酶的存在，才使鐮刀霉可以抵抗自身產(chǎn)生毒素的毒性[25]。Poppenberger等[26]從阿拉伯芥中分離出UDP-葡萄糖基轉移酶可以將一分子葡萄糖基轉移到DON的3號位碳源子上，得到DON-葡糖苷酸。進一步試驗結果表明，DON-葡萄糖苷酸的毒性作用比DON低[27]。Ma等[28]從小麥（Triticum aestivum L.）變種中獲得UDP-葡萄糖基轉移酶基因片段（TaUGT3），其在大腸桿菌DH10B中成功表達，并發(fā)現(xiàn)接種這種大腸桿菌的擬南芥提高了對DON的抵抗能力。Khatibi等[29]將2種3-O-乙?；D移酶基因片段（FgTRI101和Ff?TRRI201）克隆到酵母菌中成功表達，可有效將燃料酒精發(fā)酵副產(chǎn)物中的高濃度DON轉化為3-ADON，這一研究有一定的商業(yè)推廣應用價值。

3C-異構化作用使DON形成C-3位差向異構體3-epi-DON，但由于該降解產(chǎn)物中仍存在12,13-環(huán)氧化基團，其毒性作用與DON相當。Ikunaga等[30]從小麥地里分離到一株諾卡氏細菌WSN05-2可將DON轉化為3-epi-DON和另一種結構還未闡明的降解產(chǎn)物。在含有1 000 μg/ml的DON的基礎培養(yǎng)基中接種WSN05-2菌株反應7 d后，DON的轉化率可達90%。10 d后兩種降解產(chǎn)物均未檢測到，DON的骨架結構完全被破壞，這表明3-epi-DON和另一種代謝產(chǎn)物并不是WSN05-2代謝DON的終產(chǎn)物，而只是兩種中間產(chǎn)物。

3C-OH氧化作用使DON中的3-OH氧化為毒性比DON低的產(chǎn)物DON 3-酮基。Shima等[31]通過富集培養(yǎng)方法從土壤中篩選得到一株土壤桿菌屬的細菌E3-39，該菌在30℃厭氧條件下其胞外提取液可將培養(yǎng)基中200 μg/ml的DON代謝掉，代謝產(chǎn)物中70%為3-酮基-DON。V?lkl等[32]從自然界樣品中分離出一株具有將DON降解為3-酮基-DON的細菌，該菌在20℃條件下保存6個月仍能保持對DON的降解能力，該菌代謝DON的代謝產(chǎn)物主要為3-酮基-DON。

本課題組已從74個土壤、霉變飼料和動物腸道食糜樣品中分離出一株高效降解嘔吐毒素的細菌ANSB714，其發(fā)酵液(活菌數(shù)4.5×109CFU/ml)與初始濃度100 mg/kg的DON反應24 h，降解率為97.34%。通過生理生化和16S rRNA基因序列分析方法鑒定出該菌株為德沃斯氏菌(Devosia sp)。在模擬胃腸道條件下，對霉變小麥和DDGS中DON降解率分別為86.19%和84.34%。通過高效液相色譜-二級質譜聯(lián)用測定DON降解產(chǎn)物的分子結構，推測菌株德沃斯氏菌ANSB714降解DON的作用機制，是DON分子上的C3-OH基團被氧化為酮基的途徑。降解DON的德沃斯氏菌ANSB714毒理學和安全性評價試驗結果表明：德沃斯氏菌ANSB714對小鼠經(jīng)口急性毒性LD50大于40 ml/kg體重，對小鼠精子畸形試驗結果為陰性，對小鼠骨髓細胞微核試驗結果為陰性。

5 嘔吐毒素生物降解研究前景展望

早期報道的能生物降解嘔吐毒素的微生物大多都是來源于動物腸道的微生物混合物，混合物沒法進行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。也有降解嘔吐毒素單一菌株的報道，但是這些研究都是用菌株和毒素標準品進行的體外試驗，沒有進一步驗證其對飼料嘔吐毒素的降解效果，也沒有驗證其對動物的安全性和有效性，沒能解決實際應用問題。盡管一些動物腸道微生物對嘔吐毒素有降解作用，但是到目前為止，沒有關于嘔吐毒素降解酶的研究報道，也沒有利用這些微生物或其產(chǎn)生的酶研發(fā)飼料添加劑的相關報道。因此，尋找新的高效降解飼料DON的菌株，研究解毒作用機制，通過動物安全性和有效性評價，研究其對動物DON中毒癥的緩解和作用效果，是開發(fā)DON降解菌飼料添加劑的研究基礎。