何立群

（諸暨市人民醫(yī)院，浙江 諸暨311800）

·臨床與檢驗·

液基細(xì)胞學(xué)與細(xì)胞蠟塊對肺癌的診斷價值比較

何立群

（諸暨市人民醫(yī)院，浙江 諸暨311800）

目的分析比較液基細(xì)胞學(xué) （TCT）與細(xì)胞蠟塊單獨應(yīng)用及兩者聯(lián)合應(yīng)用對肺癌的診斷價值。方法選擇本院2013年1～12月住院疑似肺癌的患者共58例作為觀察對象，所有患者行纖維支氣管鏡針吸活檢（TBNA）收集標(biāo)本，并應(yīng)用TCT及細(xì)胞蠟塊免疫組化進(jìn)行檢測，分別比較兩種診斷方法單獨應(yīng)用與聯(lián)合應(yīng)用的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性。結(jié)果細(xì)胞蠟塊免疫組化肺癌診斷陽性率（86.20%）顯著高于TCT檢測陽性率（70.69%）（P＜0.05），TCT聯(lián)合細(xì)胞蠟塊免疫組化肺癌診斷陽性率顯著高于單用細(xì)胞蠟塊免疫組化肺癌診斷陽性率（P＜0.05）。58例疑似肺癌患者最終經(jīng)病理組織學(xué)證實為肺癌者56例，液基細(xì)胞學(xué)組敏感性（73.21%）和準(zhǔn)確性（70.69%）顯著低于細(xì)胞蠟塊免疫組化檢測的敏感性（89.29%）和準(zhǔn)確性（86.20%），聯(lián)合診斷組敏感性、特異性、準(zhǔn)確性均為100.0%，顯著高于細(xì)胞蠟塊免疫組化檢測組（P＜0.05）。結(jié)論細(xì)胞蠟塊方法較液基細(xì)胞學(xué)方法檢測肺癌有更好的靈敏度和準(zhǔn)確性，液基細(xì)胞學(xué)（TCT）和細(xì)胞蠟塊方法聯(lián)合應(yīng)用能提高肺癌診斷準(zhǔn)確性，檢測敏感性、特異性好，可為肺癌的早期診斷和治療提供依據(jù)。

TBNA；液基細(xì)胞學(xué)；細(xì)胞蠟塊；肺癌

肺癌是臨床上常見的惡性腫瘤，近年來，隨著空氣污染和工業(yè)化進(jìn)程，我國肺癌的發(fā)病率和死亡率逐年升高，嚴(yán)重威脅人類健康。盡管現(xiàn)在診治手段在不斷的更新，但肺癌的5年生存率仍僅在14%左右[1]。早期肺癌臨床癥狀不明顯，絕大多數(shù)患者在確診時已為中晚期[2]，所以早期診斷并及時治療是降低肺癌患者死亡率的關(guān)鍵。液基細(xì)胞學(xué)檢驗技術(shù)是近年來開展的一項新技術(shù)，具有標(biāo)本采集方便、易于保存、圖像清晰、三維立體感突出等優(yōu)點，提高了標(biāo)本的滿意度和異常細(xì)胞檢出率，對惡性腫瘤檢查有重要的診斷價值。近年來，本院單獨及聯(lián)合采用液基細(xì)胞學(xué)（TCT）與細(xì)胞蠟塊對肺癌進(jìn)行診斷，取得滿意結(jié)果，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2013年1～12月住院疑似肺癌的患者共58例作為觀察對象，所有患者臨床癥狀和胸部CT檢查均疑似為肺癌，其中男38例，女20例；年齡45～67歲，平均（48.3±1.31）歲。胸部CT表現(xiàn)：肺部斑片狀高密度影19例，肺部腫塊或結(jié)節(jié)32例，肺葉或肺段實變7例，伴有單側(cè)或雙側(cè)胸腔積液10例，伴有肺葉或肺段不張8例。所有患者及家屬同意行TBNA檢查，檢查前查血常規(guī)、凝血常規(guī)、乙肝五項、心電圖等均正常，并排除相關(guān)禁忌證。

1.2方法

1.2.1穿刺步驟 術(shù)前仔細(xì)閱讀胸部CT片，結(jié)合2009 IASLC新淋巴結(jié)分布圖確定淋巴結(jié)穿刺點。先經(jīng)鼻行常規(guī)纖維支氣管鏡檢查。對于支氣管鏡檢查發(fā)現(xiàn)支氣管黏膜粗糙隆起肥厚的病例先行TBNA，再行活檢刷檢。對支氣管檢查腔內(nèi)正常的病例根據(jù)CT顯示淋巴結(jié)位置行TBNA。多組淋巴結(jié)穿刺的順序按照先健側(cè)（N3），再中間（N2），然后患側(cè)（N1）的原則。抽取到足夠的細(xì)胞，完成后用新柏氏TCT保存液沖洗穿刺塑料管并盡量沖洗干凈，對不同組淋巴結(jié)穿刺物沖洗至一個TCT瓶中，將TCT樣本瓶盡快送到細(xì)胞室檢查。

1.2.2液基細(xì)胞學(xué)檢查 將樣本放入液基細(xì)胞學(xué)檢測專用杯內(nèi)，每10mL加入二硫蘇糖醇1mL，混合后放在振蕩器上震蕩15分鐘，至粘液基本溶解，將液體倒入50mL離心管中，3500r/min離心5分鐘，棄上清液后加入細(xì)胞清洗液3500r/min離心5分鐘，棄上清液后吸取沉淀物加入到新柏氏TCT細(xì)胞保存瓶中靜置10分鐘后上機(jī)（ThinPrep2000薄層制片儀）制成液基薄片，巴氏染色，中性樹膠封片。

1.2.3細(xì)胞蠟塊制作及免疫組化 將TCT保存瓶中剩余的樣本倒入尖底離心管中，2000～3000r/min離心5分鐘，棄去上清液，加入10%中性福爾馬林20mL，固定1小時，2000～3000r/min離心5分鐘后棄去固定液，加入95%酒精離心沉淀，靜置30分鐘，使細(xì)胞凝成團(tuán)塊，棄去上清液，用棉簽輕輕將細(xì)胞塊取出，用包埋紙將細(xì)胞塊包好，放入100%乙醇中脫水，二甲苯透明，浸蠟后包埋成蠟塊，進(jìn)行連續(xù)切片，行HE染色，同時進(jìn)行免疫組化（S-P法）檢測，選擇TTF1、CEA、CK5/6、P63、Syn等抗體,相關(guān)抗體及二抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，對來源不明的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行免疫組化標(biāo)記。首先將切片常規(guī)烤片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，應(yīng)用PBS緩沖液0.01mol/L在高溫高壓中進(jìn)行抗原修復(fù)，內(nèi)源性過氧化物酶體在37°C環(huán)境下孵育30分鐘，流水沖洗，山羊血清在37°C環(huán)境下孵育40分鐘，一抗過夜，加入TTF1、CEA、CK5/6、P63、Syn生物學(xué)二抗、辣根過氧化物酶孵育30分鐘，鏈霉素過氧化物酶溶液孵育30分鐘，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察切片，并拍照。免疫組化陽性判斷方法：鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過抗體孵育及DAB顯色后變?yōu)樽厣蛘呒t棕色的部位為免疫組化陽性部位。首先確定目的蛋白在胞核還是胞漿表達(dá)，核表達(dá)就應(yīng)該是核陽性，經(jīng)蘇木素復(fù)染后，棕色部位與細(xì)胞核染色后重疊。若表達(dá)于胞漿或胞膜，則細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞膜染為棕色，不與核的蘇木素染色相互重疊。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS15.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞蠟塊免疫組化檢測 鏡下顯示可疑腫瘤細(xì)胞散在分布或聚集成團(tuán)，細(xì)胞核異型性明顯，核大小不等，N/C比例失調(diào)。對可疑的腫瘤細(xì)胞免疫組化檢測可見腫瘤組織特征，細(xì)胞異型性明顯，腺癌可見腺腔形成，鱗癌可見角化珠或細(xì)胞間橋，抗體陽性。各病理分型如下圖：小細(xì)胞癌見第78頁圖7-8，部分鱗癌；低分化鱗癌見封三圖1；腺癌見封三圖2-3。

2.2不同方法檢測肺癌細(xì)胞的比較TCT鏡下能清晰的觀察到細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)及細(xì)胞背景，本次檢測41例陽性，17例陰性，肺癌診斷陽性率為70.69%。細(xì)胞蠟塊免疫組化鏡下觀察細(xì)胞類似形態(tài)與組織學(xué)活檢相似，可見組織與間質(zhì)之間的聯(lián)系，本次檢測50例陽性，8例陰性，肺癌診斷陽性率為86.20%。TCT肺癌診斷陽性率顯著低于細(xì)胞蠟塊免疫組化肺癌診斷陽性率（χ2=4.130，P＜0.05）；TCT聯(lián)合細(xì)胞蠟塊免疫組化肺癌診斷陽性率顯著高于單用細(xì)胞蠟塊免疫組化肺癌診斷陽性率（χ2=3.940，P＜0.05），詳見表1。

2.3敏感性、特異性和準(zhǔn)確性58例疑似肺癌患者最終經(jīng)病理組織學(xué)證實為肺癌56例，液基細(xì)胞學(xué)診斷敏感性為73.21%，特異性為50.0%，準(zhǔn)確性為70.69%；細(xì)胞蠟塊免疫組化組診斷敏感性為89.29%，特異性為50.0%，準(zhǔn)確性為86.2%；聯(lián)合檢測組診斷敏感性為100.00%，特異性為100.0%，準(zhǔn)確性為100.00%。細(xì)胞蠟塊免疫組化診斷肺癌的敏感性和準(zhǔn)確性均高于液基細(xì)胞學(xué)（P＜0.05），兩組診斷特異性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而兩組聯(lián)合檢測診斷肺癌的敏感性、特異性、準(zhǔn)確性均顯著高于單用液基細(xì)胞學(xué)組或細(xì)胞蠟塊免疫組化組 （P＜0.05），詳見表2。

3 討論

TBNA技術(shù)是診斷肺癌較為實用的技術(shù)，特別對原發(fā)或轉(zhuǎn)移肺癌的肺門、縱隔淋巴結(jié)評估，對縱隔腫瘤的診斷以及支氣管周圍有或無外壓改變的肺內(nèi)腫瘤的診斷。近年來，隨著操作方法和定位診斷技術(shù)的不斷完善，以及穿刺活檢針的不斷改進(jìn)，TBNA在臨床應(yīng)用越來越廣泛，目前TBNA已經(jīng)成為歐美等國家常規(guī)檢查的重要組成部分。與傳統(tǒng)“金標(biāo)準(zhǔn)”縱隔鏡相比較，具有微創(chuàng)、價廉、重復(fù)性好等優(yōu)點，一旦發(fā)現(xiàn)疑似腫瘤病灶可以實時穿刺細(xì)胞學(xué)活檢，操作方便。

在纖維支氣管鏡下進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢測或病理活檢是目前診斷肺癌的主要方法。TCT比傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)檢查優(yōu)勢大，與普通涂片相比，TCT均勻薄層，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，背景色低，能清晰的觀察細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)，肺癌診斷率較高，但敏感性和特異性不高。細(xì)胞蠟塊技術(shù)的基本原理是將細(xì)胞凝成團(tuán)塊固定后石蠟包埋，切片后進(jìn)行免疫組織化學(xué)實驗。該技術(shù)能顯著提高肺癌診斷準(zhǔn)確率，也可用于液基細(xì)胞學(xué)診斷。李印等[3]報道采用宮頸細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中的殘余液基細(xì)胞樣本做成細(xì)胞蠟塊，可顯著提高診斷率。

本文對支氣管鏡檢查發(fā)現(xiàn)支氣管黏膜粗糙隆起肥厚的病例先行TBNA，再行活檢刷檢。對支氣管檢查腔內(nèi)正常的病例則根據(jù)CT顯示淋巴結(jié)位置行TBNA進(jìn)行取材，提高了組織活檢的準(zhǔn)確性。同時在TBNA過程中出血極少，不影響其它操作。本文結(jié)果顯示，TCT肺癌診斷陽性率顯著低于細(xì)胞蠟塊免疫組化的肺癌診斷陽性率（P＜0.05），這與先前的文獻(xiàn)[4]報道結(jié)果一致，說明細(xì)胞蠟塊免疫組化診斷肺癌陽性率較高。而TCT聯(lián)合細(xì)胞蠟塊免疫組化診斷肺癌的敏感性、特異性、準(zhǔn)確性顯著高于各自單獨診斷方法（P＜0.05），說明兩種檢測方法聯(lián)合應(yīng)用可進(jìn)一步提升肺癌診斷率。細(xì)胞蠟塊組織切片與液基涂片中的肺癌細(xì)胞相比較，形態(tài)結(jié)構(gòu)差距較小，單用兩種方法肺癌細(xì)胞的敏感性診斷較弱，本文通過采用液基細(xì)胞學(xué)法與細(xì)胞蠟塊組織切片法相結(jié)合，兩者間相互補(bǔ)充能夠更好的提升診斷效果，還能夠達(dá)到組織學(xué)活檢的目的，能為腫瘤的組織學(xué)分型、來源以及個體化治療提供幫助[5-8]。晚期肺癌患者有時以體腔積液為首發(fā)癥狀，而傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)檢查僅提供惡性腫瘤的診斷，對于原發(fā)病灶的尋找并沒有幫助，但細(xì)胞蠟塊組織切片具有可以反復(fù)連續(xù)切片的優(yōu)點，因此應(yīng)用細(xì)胞切片進(jìn)行的其他輔助檢查，可以為尋找原發(fā)病灶提供線索，該方法的應(yīng)用對于不易獲取組織標(biāo)本的晚期肺癌患者具有更重要的意義[9]。將液基細(xì)胞學(xué)法與細(xì)胞蠟塊組織切片法相結(jié)合后，作為一種改良的細(xì)胞學(xué)制片技術(shù)，更能提高肺癌組織學(xué)分型的符合率[10]。液基細(xì)胞學(xué)法聯(lián)合細(xì)胞蠟塊組織切片法對于難以取得組織活檢標(biāo)本的肺癌 （如腫塊表面出血壞死、氣管鏡下看不到腫塊等情況）的病理組織分型診斷有著非常重大的意義。

綜上所述，TCT和細(xì)胞蠟塊方法聯(lián)合應(yīng)用對于診斷肺癌細(xì)胞臨床效果很好，為肺癌的早期診斷和治療提供依據(jù)。

[1]馬云帆，范夢穎，陳克能.肺鱗癌與肺腺癌的免疫組化指標(biāo)的診斷及預(yù)后意義.中國肺癌雜志，2014，17（6）：506

[2]劉紹信，周永威，劉健，等.肺原發(fā)性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的CT表現(xiàn).醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志，2014，24（2）：235

[3]李印，何海生，李清苗，等.細(xì)胞模塊技術(shù)在宮頸陰道病變液基細(xì)胞學(xué)檢查中的應(yīng)用.臨床與實驗病理學(xué)雜志，2011，27（3）：337

[4]劉萍，羅艷敏.細(xì)胞塊技術(shù)在肺癌支氣管鏡刷檢標(biāo)本中的應(yīng)用價值.江西醫(yī)學(xué)，2014，4（1）：374

[5]Lai YJ，Tseng WL.Role of 5-thio-（2-nitrobenzoic acid）-capped gold nanoparticles in the sensing of chromium（vi）: remover and sensor.The Analyst，2011，136（13）:2712

[6]鄭姮，段楚驍，付圣靈，等.CK5/6和CK7非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及臨床意義.臨床外科雜志，2013，21（9）：700

[7]Hoornstra D，Andersson MA，Teplova VV，et al.Potato crop as a source of emetic Bacillus cereus and cereulide-induced mammalian cell toxicity.Applied and environmental microbiology，2013，79（12）:3534

[8]Zhang Y，Wang KP.Evolution of transbronchial needle aspiration-a hybrid method.Journal of thoracic disease，2013，5（3）:234

[9]姜威，張安生.非小細(xì)胞肺癌中Kiss-1及CD34表達(dá)的臨床意義.中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2014，16（1）：58

[10]雷勇靜，陳傳英，劉曉彬，等.無痛纖維支氣管鏡檢查的麻醉進(jìn)展.中國醫(yī)師進(jìn)修雜志，2014，37（12）：74