鄭雅萍，袁青，陳偉

（金華市中心醫(yī)院，浙江 金華321000）

實(shí)時(shí)核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在奈瑟菌感染檢測(cè)中的應(yīng)用

鄭雅萍，袁青，陳偉

（金華市中心醫(yī)院，浙江 金華321000）

目的探討實(shí)時(shí)核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（SAT法）在淋病奈瑟菌感染檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。方法取153例疑似淋病奈瑟菌感染的女性患者宮頸分泌物標(biāo)本采用直接涂片法、分離培養(yǎng)法及SAT法進(jìn)行淋病奈瑟菌檢測(cè)，同時(shí)對(duì)對(duì)應(yīng)的153份尿液標(biāo)本也進(jìn)行SAT法的淋病奈瑟菌檢測(cè)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較分析。結(jié)果淋病奈瑟菌檢測(cè)中直接涂片法陽性率為31.4%，分離培養(yǎng)法陽性率為47.7%，SAT法陽性率為51.6%，SAT法與分離培養(yǎng)法檢測(cè)淋病奈瑟菌陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），而直接涂片法淋病奈瑟菌陽性率較低，與分離培養(yǎng)法比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；以分離培養(yǎng)法作為金標(biāo)準(zhǔn)，SAT法的檢測(cè)敏感性為95.9%（70/73），特異性為88.8%（71/80）；采用SAT法對(duì)153例患者的拭子標(biāo)本和尿液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，兩者檢測(cè)結(jié)果的符合率為100%。結(jié)論SAT法檢測(cè)女性宮頸分泌物拭子標(biāo)本和尿液標(biāo)本中的淋病奈瑟菌敏感性高、特異性強(qiáng)，能有效提高檢出率；以尿液代替拭子標(biāo)本，采樣方便。

淋病奈瑟菌；直接涂片法；分離培養(yǎng)法；實(shí)時(shí)核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

淋?。℅U）是由淋病奈瑟氏菌感染引起的性傳播疾?。⊿TD），以泌尿生殖道化膿性炎癥為主要特點(diǎn)，在世界上廣泛流行，我國發(fā)病率也較高，由于其臨床表現(xiàn)缺乏特異性，診斷主要依靠實(shí)驗(yàn)室檢查。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法有直接涂片法、分離培養(yǎng)法等，隨著核酸檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床，實(shí)時(shí)核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（simultaneous amplificationand testing，SAT法）成為一種最新的檢測(cè)手段。該技術(shù)作為新一代的核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)，被廣泛地應(yīng)用到病原體檢測(cè)、病毒篩查等領(lǐng)域。本文通過對(duì)153例臨床疑似女性淋病患者的標(biāo)本采用直接涂片法、分離培養(yǎng)法以及SAT法進(jìn)行淋病奈瑟菌檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較分析，為臨床醫(yī)生正確選擇檢測(cè)方法提供參考，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2013年1月～2014年3月來本院婦科門診就診的臨床疑似女性淋病患者共153例，年齡18～55歲。所有病例均具有以下一種或多種臨床表現(xiàn)：尿道口紅腫、分泌物明顯增多、膿性白帶，尿頻尿急尿痛等。

1.2標(biāo)本采集 每個(gè)患者取3份陰道分泌物拭子標(biāo)本和1份尿液標(biāo)本。拭子標(biāo)本采集:婦產(chǎn)科醫(yī)師用特制無菌棉拭子伸入女性宮頸口約1～2cm，旋轉(zhuǎn)1周，停留10秒鐘后采集分泌物標(biāo)本，一式三份，分別置于無菌采樣管立即送檢。其中1支拭子采樣后將拭子在1.5mL生理鹽水中洗滌。將該洗液震蕩混勻后吸取1mL至另一只裝有1mL樣本保存液（SAT試劑盒組分）的標(biāo)本冷凍保存管中，并混勻；置于-20℃保存?zhèn)溆?，用于SAT檢測(cè)。尿液標(biāo)本采集：長時(shí)間（至少1小時(shí)）不排尿后的首段尿1mL與1mL尿液保存液（SAT試劑盒提供）混合，即為待測(cè)樣本，于-20℃保存，用于SAT檢測(cè)。

1.3檢測(cè)方法 標(biāo)本采集后立即進(jìn)行涂片革蘭染色，油鏡下查找革蘭陰性雙球菌，以在多形核白細(xì)胞內(nèi)或胞外發(fā)現(xiàn)革蘭陰性雙球菌即為陽性。另取一支拭子接種于T-M專用巧克力培養(yǎng)基，置35℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)24～48小時(shí)，將培養(yǎng)獲得的可疑菌落嚴(yán)格按鑒定程序進(jìn)行鑒定。另取已留取的尿液標(biāo)本和拭子洗脫液標(biāo)本進(jìn)行SAT法的淋病奈瑟菌

檢測(cè)?？焖俑锾m染色試劑盒購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，培養(yǎng)基購自上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司，采用生物梅里埃VITEK2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)和配套試劑鑒定分析。SAT法檢測(cè)試劑盒和核酸提取儀由上海仁度生物科技有限公司提供，LightCycle480熒光定量PCR儀購自Roche公司，嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1拭子標(biāo)本淋病奈瑟菌檢出率 直接涂片法陽性率為31.4%（48/153），分離培養(yǎng)法陽性率為47.7%（73/153），SAT法陽性率為51.6%（79/153），SAT法與分離培養(yǎng)法檢測(cè)淋病奈瑟菌陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），而直接涂片法淋病奈瑟菌陽性率較低，與分離培養(yǎng)法比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。詳見表1。

2.2SAT法檢測(cè)拭子標(biāo)本淋病奈瑟菌的敏感性和特異性 以分離培養(yǎng)法作為金標(biāo)準(zhǔn)，SAT法的檢測(cè)敏感性為95.9%（70/73），特異性為88.8%（71/80）。

2.3SAT法對(duì)拭子和尿液標(biāo)本的檢測(cè)符合率 采用SAT法對(duì)153例患者的拭子標(biāo)本和尿液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，陽性79例，陰性74例，與拭子檢測(cè)結(jié)果符合率為100%。

3 討論

我國女性淋病的患病率 （0.08%）高于男性（0.02%），但女性淋病患者可以無典型臨床癥狀而被忽視，約有60%的女性淋病患者無明顯自覺癥狀，呈隱性感染或帶菌狀態(tài)[1]。無癥狀女性淋病患者在傳播淋病奈瑟菌感染中起重要作用。因此，在孕前體檢中早期篩查出女性淋病患者對(duì)預(yù)防新生兒淋病、執(zhí)行優(yōu)生優(yōu)育政策有重要意義。

奈瑟菌檢測(cè)的方法多樣。傳統(tǒng)的直接涂片法雖然操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、費(fèi)用省，但對(duì)女性慢性奈瑟菌感染患者或經(jīng)抗生素治療后的病例，因淋病奈瑟菌數(shù)量減少，且可以發(fā)生形態(tài)變異，涂片鏡檢難以區(qū)分陰道分泌物中的雜菌與淋病奈瑟菌，常出現(xiàn)假陰性結(jié)果，故其陽性檢出率較低。有文獻(xiàn)報(bào)道直接涂片法對(duì)急性期患者的標(biāo)本具有初步的診斷價(jià)值，但對(duì)無癥狀即慢性期的男女性標(biāo)本陽性檢出率很低[2]。培養(yǎng)法一直是WHO推薦的診斷淋病的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其陽性結(jié)果即有診斷意義，可以彌補(bǔ)直接涂片法的形態(tài)學(xué)辨認(rèn)困難的缺點(diǎn)，提高檢出率。但由于淋病奈瑟菌對(duì)環(huán)境和營養(yǎng)要求較高，離開人體后很快死亡，且有自溶酶，因此對(duì)標(biāo)本的采集、運(yùn)送要求較高，同時(shí)還可能因標(biāo)本量過少、抗生素的使用、接種后病原微生物不成活等因素而導(dǎo)致檢測(cè)假陰性。

SAT法是建立在RNA恒溫?cái)U(kuò)增和實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)基礎(chǔ)上的第二代核酸檢測(cè)技術(shù)，其基本原理是同一溫度下，首先通過M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生靶標(biāo)核酸RNA的1個(gè)雙鏈DNA拷貝，然后利用T7RNA多聚酶從該DNA拷貝上產(chǎn)生多個(gè)RNA拷貝，同時(shí)帶有熒光標(biāo)記的探針和這些RNA拷貝特異結(jié)合，產(chǎn)生熒光，該熒光信號(hào)可由熒光檢測(cè)儀器實(shí)時(shí)捕獲，實(shí)時(shí)反映擴(kuò)增循環(huán)情況，利用熒光信號(hào)的變化通過計(jì)算機(jī)對(duì)起始RNA進(jìn)行分析[3]。其檢測(cè)的是病原體RNA，因活菌中才有完整的RNA片段，因此相當(dāng)于檢測(cè)活菌，有利于臨床用藥后的療效監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷[4]。RNA在環(huán)境中極不穩(wěn)定，容易降解，降低了核酸擴(kuò)增檢測(cè)中交叉污染引起的假陽性問題，污染概率小。本研究中SAT法與分離培養(yǎng)法檢測(cè)淋病奈瑟菌陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），而直接涂片法淋病奈瑟菌陽性率較低，與分離培養(yǎng)法比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

另外，以分離培養(yǎng)法作為金標(biāo)準(zhǔn)，SAT法的檢測(cè)敏感性為95.9%（70/73），特異性為88.8%（71/80），敏感性和特異性均較高。本研究中通過拭子標(biāo)本和尿液標(biāo)本的平行檢測(cè)，結(jié)果兩者檢出陽性率一致，說明了在取樣時(shí)可以以尿液標(biāo)本代替拭子標(biāo)本，取材較為方便。

在本研究中出現(xiàn)SAT陽性而直接涂片法陰性的病例，可能的原因有患者經(jīng)過治療，病情減輕轉(zhuǎn)化成慢性炎癥，導(dǎo)致淋病奈瑟菌數(shù)目明顯減少，或者是分泌物中其它雜菌的干擾導(dǎo)致，淋病奈瑟菌形態(tài)變異難以辨認(rèn)等[5]。SAT法陽性而培養(yǎng)法陰性，可能的原因有標(biāo)本采集量太少，運(yùn)送過程保溫不當(dāng)致菌體死亡，培養(yǎng)條件不當(dāng)，抗生素使用等易引起培養(yǎng)法的假陰性。SAT法陰性而培養(yǎng)法陽性，可能由于SAT檢測(cè)的是病原體RNA，RNA在環(huán)境中極易降解，標(biāo)本保存不當(dāng)或特異性核酸序列突變[6]均可引起SAT法假陰性。SAT法特異性強(qiáng)、敏感度高，特別對(duì)于臨床癥狀不典型的疑似病例或經(jīng)抗生素治療后的女性淋病患者，能提高檢出率，對(duì)于疑似病例的早期診斷具有重要臨床意義。

[1]張樹文，蘇曉紅，潘麗.基層適宜的淋病奈瑟菌檢驗(yàn)技術(shù).中國計(jì)劃生育志，2013，21（7）:502

[2]徐新蓉，馬萍，龔國富.不同癥狀淋病奈瑟菌感染患者實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法選擇與比較.國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012，33（21）:2637

[3]顧偉鳴，楊陽，吳磊，等．實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)泌尿生殖道沙眼衣原體感染.臨床檢驗(yàn)雜志，2010，28（4）：271

[4]高志華，金印，陳峰.實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)尿液中淋病奈瑟菌的分析.國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012，33（4）:463 [5]楊丙蓮.不同方法檢測(cè)淋球菌的臨床應(yīng)用探討.中外醫(yī)療，2013，36：172

[6]Raherison S，Clerc M，Trombert S，et al.Real-time high resolution melting PCR for identification of the Swedish variant of Chlamydia trachomatis.JM icrobiol Methods，2009，78（1）:101