張袁骕 裘華森★ 程向東 徐志遠

·綜述·

外周血miRNA與胃癌早期診斷相關研究進展

張袁骕 裘華森★ 程向東 徐志遠

胃癌（Gastric Cancer）在我國惡性腫瘤發(fā)病率和病死率均排在第2位，目前主要依靠早期明確診斷和手術相結合的方法提高胃癌患者的生存率，且按TNM分期標準，經(jīng)個體化綜合治療后Ⅲ、Ⅳ期患者的5年生存率顯著低于I、II期［1］。＞80%胃癌患者中晚期才被確診，因此有必要探索一種新的特異性和敏感性高的腫瘤標記物應用于胃癌的早期診斷。目前外周血中可用的胃癌標記物主要有AFP、CEA、CA-125和CA-199等對于進展期胃癌診斷有較高的敏感性，而對于早期胃癌診斷卻無明顯的差異［2］。近年關于miRNA的研究表明，外周血MicroRNA（miRNA）的種類及表達水平在癌癥和其他疾病的狀態(tài)下出現(xiàn)顯著的改變，且外周血miRNAs作為胃癌等腫瘤診斷標記物的研究逐漸成為新的研究熱點。

1　外周血miRNAs

miRNA是在動植物中發(fā)現(xiàn)的一類內源性的起重要調控功能的非編碼RNA，其大小約＜22個核苷酸［3］。大多數(shù)miRNAs是經(jīng)RNA聚合酶II初步轉錄后的長鏈miRNA（primiRNA），pri-miRNAs再經(jīng)過兩次連續(xù)的酶促（Drosha酶和Dicer酶）裂解反應。成熟的miRNAs主要通過脫腺苷化促進目標miRNAs裂解或抑制翻譯對基因轉錄后表達起到調控作用［4］。

1.1外周血miRNAs特性 盡管miRNAs的生物功能并未被完全了解，但miRNAs的分析顯示大部分類型腫瘤的表達譜與正常組織之間存在顯著差異。因此，miRNAs作為一類高度組織特異性生物標記物，在各類診斷實驗中用于臨床診斷腫瘤的組織來源［5］。由于血清中存在大量核糖核酸酶（RNase），因此推理血清中不應該有完整的RNA。但研究結果卻表明miRNAs與已知的循環(huán)核酸一樣穩(wěn)定，可在室溫下24h或8次凍融后仍保持穩(wěn)定，并廣泛存在于人類外周血、尿液等外周循環(huán)中。Li等［6］研究，miRNAs經(jīng)不同條 件（包括不同溫度、持續(xù)時間、pH值、RNase A消化、DNase I消化及各種凍融循環(huán)）處理后，使用qRT-PCR分析后顯示腫瘤相關miRNAs仍可被檢測到，表明miRNAs極其穩(wěn)定并可抵抗嚴酷環(huán)境引起的破壞和降解。Mitchell等［7］通過建立異種移植獲得的miRNAs與外周血miRNAs對照試驗，并進行TaqMan qRT-PCR定量檢測顯示外周血miRNAs的分子結構具有一定對抗RNase的能力。

1.2外周血miRNAs作為生物標志物 一種新的有效的生物標志物也有助于腫瘤的診斷和臨床管理，最佳的生物標志物是可以通過無創(chuàng)傷的方式且易于獲取的。由于外周血miRNAs在不同溫度、酸堿環(huán)境及物理狀態(tài)等條件下仍能維持穩(wěn)定，且外周血miRNAs有一定的組織特異性，因此檢測腫瘤患者的外周血miRNAs表達情況并從中篩選出可用于診斷胃癌等惡性腫瘤的生物標志物。Lawrie等［8］研究第一次發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性的外周血miRNAs，miRNA-21在彌漫性大B細胞淋巴瘤患者血清中高度表達。Ng等［9］應用qRT-PCR分別對結腸癌細胞、癌旁正常結腸組織、患者血漿和健康對照組的miRNAs表達譜進行分析，該實驗顯示5種miRNAs在腫瘤細胞及腫瘤患者血漿中相對于健康志愿者存在明顯的過表達，同樣外周血miRNAs也被分析用于早期癌癥診斷的可行性。Huang等［10］研究早期結腸癌患者外周血中miRNAs表達情況，其中miR-29a和miR-92a用于區(qū)別早期結腸癌和健康人群有83.0%的敏感性和84.7%的特異性。這些數(shù)據(jù)均表明非細胞的miRNAs可潛 在用于癌癥的早期診斷。這類 新的生物標志物對于癌癥早期這一無癥狀階段的診斷有十分重要的意義。

1.3外周血miRNAs提取及檢測方法 由于外周血中RNA含量較低且miRNAs一般只占1%～5%［3］，所以需要盡可能將miRNAs濃縮至一個較小的體積以提高濃度，從而進行下一步實驗檢測。目前公認提取外周血中miRNAs較為有效的試劑盒有Ambion公司的mir Vana PARIS K it和Qiagen公司的miRNeasy kit，但現(xiàn)在仍無針對大批量外周血樣本進行有效提取的方案［11］。根據(jù)不同研究目的對miRNAs定量檢測方法主要有以下幾種：Northern印跡法、核糖核酸酶保護分析（RPA）、基因芯片技術和RT-PCR。Northern印跡法對設備與技術要求相對簡單，是miRNA分析的常用方法，但其傳統(tǒng)基因探針敏感性不高、耗時相對較長和對樣本中miRNAs的濃度有一定要求等缺點，限制其用于外周血miRNAs檢測應用。核糖核酸酶保護分析（RPA）是近10年發(fā)展起來的一種全新的miRNAs定量分析方法，以靈敏、準確和高通量為特征，在國外廣泛應用于miRNAs分析研究，但由于其價格原因未在國內普遍使用?；蛐酒夹g（microarrays）適用于大量篩選且檢測速度較快，但設備、樣本制作要求高，目前多用于前期篩選工作，未能在實驗室和臨床中廣泛應用。對于外周血miRNAs的檢測目前主要依賴于RT-PCR，包括poly（A）加尾RT-PCR法、探針RTPCR方法和頸環(huán)RT-PCR法，其中poly（A）加尾RT-PCR法因其經(jīng)濟、時效等特點為目前較為常用的實時定量PCR檢測方法。

2　miRNAs與胃癌

2.1幽門螺桿菌感染相關miRNAs 大量研究證明幽門螺桿菌（HP）感染對胃癌的發(fā)生存在顯著影響，根據(jù)Eurogast小組研究結果顯示HP感染人群胃癌發(fā)病率相對未感染人群增加6倍。WHO也將其列為胃癌的I類致癌原。多項研究［12，13］表明HP感染根治者相對感染者在慢性萎縮性胃炎、腸化生、異型性增生和胃癌的發(fā)病率上有顯著的減少，提示HP感染在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中存在一定作用。目前認為胃癌多是由HP感染等致病原導致的慢性炎癥所引起，檢測并分析HP感染胃組織、正常組織以及胃癌組織之間miRNAs的表達差異，有助于明確miRNAs在胃癌發(fā)生及進展過程中的機制和作用。Zhang等［14］分別對感染HP的胃黏膜組織、正常胃黏膜、人胃腺癌細胞（AGS細胞）及胃癌組織的miRNAs表達譜進行檢測，通過RT-PCR技術證實miR-21在AGS細胞、感染HP的胃黏膜及胃癌組織中表達均顯著升高，表明miR-21過表達的胃癌部分是源于HP感染。且進一步研究證實miR-21通過下調RECK（抑癌基因）的表達，從而導致胃癌的發(fā)生。最近研究發(fā)現(xiàn)miR-21還可以抑制一種新的抑癌蛋白—程序性細胞凋亡因子4（PDCD4），其在胃癌患者中表達明顯下降，并且腫瘤的大小、分化程度、淋巴結轉移、血管浸潤和臨床預后不佳與miR-21高表達和PDCD4低表達有關，miR-106a高表達時也存在類似現(xiàn)象。有研究［15］表明HP感染可誘導miR-124發(fā)生甲基化使其沉默轉變?yōu)閙iR-124a，且胃癌組織中miRNAs甲基化的比例顯著升高。Hayashi等［16］研究認為，HP細胞毒素相關蛋白A（CagA）在體內外均可以通過對蛋白組修飾和DNA甲基化等方式引起let-7基因異常的表現(xiàn)遺傳沉默，從而激活Ras信號通路導致胃癌發(fā)生。這些均表明HP感染與胃癌的發(fā)生發(fā)展存在一定的聯(lián)系。

2.2miRNAs與早期胃癌診斷 胃癌和大多數(shù)腫瘤一樣，盡量做到早期發(fā)現(xiàn)，但目前早期診斷仍然比較困難。大部分胃癌患者早期無明顯的異常感，且尚無有效的常規(guī)臨床篩查方法，常明確診斷時多發(fā)展至中位生存期只有7～9個月的晚期胃癌［17］。因此確立一種規(guī)范的早期胃癌診斷及管理方式應作為胃癌相關研究的長期目標。近年來，學者們著手研究外周血中miRNAs作為早期胃癌標記物的可行性。例如，血清中miR-375表達與胃癌組織中一樣明顯下調，ROC曲線下面積（AUC）為0. 835，在區(qū)別遠端胃腺癌與健康對照組之間的敏感性和特異性分別為85%和80%［18］。MiR-421在胃癌組織表達明顯上升，且與胃癌臨床癥狀之間無明顯關系，該miRNA可能與早期胃癌發(fā)生有關［19］。由于miR-421檢測胃癌的陽性率明顯高于血清癌胚抗原，可作為有效的早期胃癌生物標記物。Song等［20］研究中16種血清miRNAs與對照組表達比較明顯上調，其中miR-221， miR-744和miR-376c采用ROC曲線判斷敏感性和特異性分別為82.4%和58.8%，且miR-221和 miR-376c與胃癌的分化程度呈負相關。Liu等［21］應用miRNA芯片技術對早期胃癌患者和健康對照組血漿中miRNAs進行研究發(fā)現(xiàn)miR-187， miR-371-5p和miR-378表達提高，進一步對miR-378分析得出ROC曲線下面積（AUC）為0.861，87.5%的敏感性和70.73%的特異性。國芳等［22］也對血清中miRNAs進行研究，通過qRTPCR分析得出早期胃癌中miR-1和miR-20a的表達明顯升高（P＜0.05），ROC曲線下面積（AUC）分別為0.8138和0.7742，兩者聯(lián)合的AUC為0.8653，敏感性和特異性分別為80.5%和83.6%，進展期胃癌中miR-1的表達顯著高于早期胃癌（P=0.0121）。這些研究數(shù)據(jù)進一步支持miRNAs作為潛在的胃癌標記物，有助于早期明確診斷，包括胃癌類型、部位、浸潤程度等并予以及時治療，從而降低胃癌患者的病死率。

3　總結與展望

近年來miRNAs成為胃癌等惡性腫瘤研究的熱點，且大量研究均證實其為潛在的胃癌診斷標記物。但其仍有分析方法和技術的局限性，例如各種發(fā)表的研究報道中不同的檢測方法種類、分析軟件及標準化指標。因此，確立一種標準化的提取及檢測方法及觀察指標是未來胃癌相關miRNAs的一種研究趨勢。盡管miRNAs已被證明與胃癌相關，但由于不同的患者之間存在的個體差異，即使相同類型的癌癥，僅使用一個生物標記物作為確定其癌癥狀態(tài)的可靠性仍存在疑問。為此幾種miRNAs的唯一組合可以有效地用于診斷目的。例如，在肝硬化患者中觀察到的miR-106b低表達和miR-181b高表達，其ROC曲線下面積（AUC）分別為0.715 和0.833，而兩者聯(lián)合的AUC為0.882。這些數(shù)據(jù)證明了miR-106b和miR-181b的聯(lián)合檢測對肝硬化患者具有更大的臨床診斷價值［23］。因此，一個生物標記物的集合對應一種疾病可能成為一種擁有更高靈敏度，特異性和準確性的診斷工具。

隨著科研技術的不斷發(fā)展，外周血miRNAs的提取及檢測方法將趨于簡化，進一步大規(guī)模調查及驗證miRNAs作為常規(guī)的臨床檢驗及無創(chuàng)性篩查工具是必要的，不再局限于實驗研究中，而是可以應用于臨床診斷中，將其列入生物標志物以提升早期胃癌診斷和預后。

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浙江省中醫(yī)藥重點研究計劃（2012ZZ002）

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