朱雨嵐，王迪，劉文娟

由缺氧誘導(dǎo)的缺血性腦動脈收縮是缺血性腦血管疾病的重要發(fā)病機制，最終導(dǎo)致腦缺血后細胞死亡[1-2]。到目前為止，缺血、缺氧引起腦動脈收縮的確切機制仍未闡明，有報道指出，缺氧對電壓依從性鉀通道（voltagegated potassium channels，Kv）的抑制作用與缺氧誘導(dǎo)的腦動脈收縮密切相關(guān)[3-4]，主要是通過抑制腦動脈全細胞鉀電流使細胞膜去極化、細胞內(nèi)鈣增加，最終引起腦動脈收縮。目前已知腦動脈平滑肌細胞上存在4種不同類型的鉀通道，其中Kv1.5和Kv2.1在缺氧性腦動脈收縮中發(fā)揮重要作用[5-6]。15-羥二十碳四烯酸（15-hydroxyeicosatetraenoic acid，15-HETE）是花生四烯酸（arachidonic acid，AA）經(jīng)15-脂加氧酶（15-lipoxygenase，15-LOX）代謝生成的主要產(chǎn)物之一，能在包括腦動脈在內(nèi)的一系列血管床中產(chǎn)生強烈的血管收縮作用[7-8]。另外，缺氧可以誘導(dǎo)腦動脈15-LOX表達增加，同時增加腦動脈對15-HETE的敏感性[9]。

本課題組前期的研究顯示15-HETE可以通過抑制腦動脈平滑肌細胞（carotid artery smooth muscle cell，CASMC）Kv通道的表達從而引起腦動脈收縮[10]，而15-LOX作為催化15-HETE生成的關(guān)鍵酶，它在缺血缺氧性腦損傷中的作用如何，是否參與了15-HETE對Kv通道的調(diào)控？為了解決這個問題，本研究利用RNA干擾技術(shù)上調(diào)和下調(diào)15-LOX的表達；采用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）法測定15-HETE生成量的變化；再分別采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）和Western-blot技術(shù)測定Kv2.1基因和蛋白質(zhì)表達的變化，對此展開探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康Wistar大鼠，體重200～250 g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動物實驗中心提供。

1.1.2 主要試劑 15-HETE和15（S）-HETE EIA試劑盒購自美國Cayman公司，15-LOX抗體和Kv2.1通道兔多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG抗體購自美國ZSGB-BIO公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)（transcription-polymerase chain reaction，PCR）試劑盒及100 bp脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Ladder均購自美國Fermentas公司，Trizol、Opti-MEM培養(yǎng)基和脂質(zhì)體（Lipofectamine）TM 2000購自美國Invitrogen公司，F(xiàn)uGENTM6購自美國Promega公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器 低溫高速離心機（Heraeus公司），臺式高速冷凍離心機（Weofuge公司），PCR儀（Px220602，Thermo電子公司），電泳凝膠成像分析儀（GDS-7500，BIO-RAD公司），體視立體顯微鏡（SMZ-168，Motic公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠CASMC分離與培養(yǎng) Wistar大鼠，腹腔注射3 ml/kg水合氯醛（10%）麻醉，斷頭取腦，置于4℃的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）中，在立體顯微鏡下小心剝離出腦動脈，剪成1～2 mm長的小段，將血管段置于4 mg/ml木瓜蛋白酶（papain）液［含1 mg/ml牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）］中37℃進行振蕩消化18 min；換入1 mg/ml膠原酶Ⅱ液（含1 mg/ml BSA）中，37℃繼續(xù)消化20 min；再換入含20%小牛血清和1%青霉素/鏈霉素的細胞培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）溶液中，用吸管吹打得到細胞懸液；低速離心10 min，棄上清，用含20%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM溶液制成細胞懸液，轉(zhuǎn)入6孔板中，置于37℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。采用免疫組化法鑒定平滑肌細胞。原代培養(yǎng)的CASMC長滿后，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，培養(yǎng)至第3代。

1.2.2 分組設(shè)計 實驗前向培養(yǎng)的細胞中加入含有0.3%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)12 h以終止細胞生長，將細胞隨機分為4組。A組為正常細胞常氧組（對照組）：將細胞放入37℃，5%CO2及95%O2的常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；B組為正常細胞缺氧組：將細胞放入3%O2，5%CO2和92%N2的缺氧箱中培養(yǎng)48 h；C組為15-LOX基因過表達細胞常氧組：對細胞上的15-LOX進行基因過表達，然后放入常氧箱中培養(yǎng)48 h；D組為15-LOX基因敲除細胞缺氧組：對細胞上的15-LOX進行基因敲除，然后放入缺氧箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.3 15-LOX基因過表達及CASMC 基因敲除15-LOX基因過表達按照FuGENTM6轉(zhuǎn)染試劑盒說明進行操作。以1×105個/孔的濃度接種于6孔板，細胞貼壁生長融合至50%～80%后更換為無血清Opti-MEM（Invitrogen，Carlsbad，CA）優(yōu)化培養(yǎng)基，用100 ?l Opti-MEM稀釋3 ?l轉(zhuǎn)染試劑FuGENTM6并輕輕混合，取1 ?g pcDNA3.1/NotI：15-LOX-XbaI質(zhì)粒（Invitrogen，Carlsbad，CA）于已稀釋的FuGENTM6，輕輕混合后室溫孵育20 min，將上述的混合物或單獨載體均勻滴入6孔板。6 h后，細胞更換為全培養(yǎng)基。

CASMC基因敲除按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明進行操作。用250 ?l Opti-MEM稀釋5 ?l轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000至1.5 ml的EP管中，輕輕混合并室溫孵育5 min。與此同時，在另一個1.5 ml的EP管中用250 ?l Opti-MEM稀釋小分子干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），輕輕混合室溫孵育5 min。孵育完成之后，將稀釋的LipofectamineTM2000和稀釋siRNA混合，室溫孵育20 min，形成siRNALipo2000混合物。將siRNA-Lipo2000混合物均勻地滴入6孔板，6 h后細胞更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后進行后續(xù)實驗。

對細胞進行裂解，用Western-blot和RTPCR的方法鑒定15-LOX過表達和敲除是否成功。

1.2.4 ELISA法測定CASMC的15-HETE生成量 分別設(shè)空白孔、標準品孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品孔中加入標準品50 μl；在酶標包被板上待測樣品孔中先加15-HETE稀釋液40 μl，然后再加待測15-HETE10 μl（樣品最終稀釋度為5倍）。待測樣品孔每孔加入酶標試劑50 μl，輕輕晃動混勻，37℃溫育60 min。棄去液體，甩干，每孔加滿稀釋后洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。如此重復(fù)5次，拍干。待測樣品孔每孔先加入顯色劑A50 μl，再加入顯色劑B50 μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min。取出酶標板，每孔加終止液50 μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。15-HETE測定：以空白孔調(diào)零，在450 nm波長下測量各孔的吸光度值（value of optical density，OD值），根據(jù)標準品的濃度及對應(yīng)的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出15-HETE濃度。

1.2.5 RT-PCR測定CASMC的Kv2.1 mRNA表達 將各組CASMC用冷的PBS沖洗3遍，采用Trizol法提取RNA。取各組總RNA3 μg，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。PCR引物序列及反應(yīng)條件為：

引物序列：①Kv2.1（X16476）：上游引物：5’-CACCATCGCTCTGTCACTCA-3’；下游引物：5’-GCAGGCCCAGTTCGTTGTA-3’，

擴增出395 bp片段。②β-actin（BC063166）：上游引物：5’-CCGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3’；下游引物：5’-CGGACTCATCGTACTCCTGCT-3’，擴增出230 bp片段。

PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 2 min，94℃45 s、49℃ 45 s、72℃ 45 s，循環(huán)32次，72℃總延伸5 min。用凝膠成像分析系統(tǒng)測定Kv2.1與內(nèi)標β-actin的條帶密度值，取兩者條帶密度值比值進行半定量分析。

1.2.6 Western-blot測定CASMC的Kv2.1蛋白質(zhì)表達 將各組CASMC用冷的PBS沖洗3遍，每孔中加入200 μl裂解液［1%諾乃洗滌劑（Nonidet）P-40，0.5%脫氧膽酸鈉（sodium deoxycholate），0.1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS），100 μg/ml苯甲磺酰氟（phenyl methyl sulfonyl fluoride），30 μl/ml抑肽酶（aprotinin）］，冰上裂解30 min。4℃，12 000 r/min離心10 min，取上清。Bradford法進行蛋白定量。8%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入兔多克隆Kv2.1抗體（1∶500稀釋）4℃過夜（以β-actin作為內(nèi)參），洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5000稀釋）室溫孵育1 h?；瘜W(xué)發(fā)光法發(fā)光，X線膠片顯影，Bio-Rad圖像處理系統(tǒng)對X線膠片進行掃描，Quantity one軟件測定條帶密度，進行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料如符合正態(tài)分布采用（s）表示，組間比較采用方差分析，3個實驗組與對照組間比較采用Dunnett-t檢驗進行兩兩比較。計數(shù)資料用頻數(shù)或百分位數(shù)表示，組間比較用卡方檢驗，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 15-LOX對CASMC的15-HETE生成量的影響 實驗重復(fù)8次（n=8），與正常細胞常氧組比較，缺氧組及15-LOX基因過表達細胞常氧組15-HETE生成量均增加（P＜0.01）；而與正常細胞缺氧組比較，15-LOX基因敲除細胞缺氧組15-HETE生成量則減少，差異有顯著性（P＜0.01）（圖1）。

2.2 15-LOX對CASMC Kv2.1通道m(xù)RNA表達的影響 實驗重復(fù)8次（n=8），與正常細胞常氧組比較，缺氧組及15-LOX基因過表達細胞常氧組的Kv2.1 mRNA表達均下調(diào)（P＜0.01）；而與正常細胞缺氧組比較，15-LOX基因敲除細胞缺氧組的Kv2.1 mRNA表達則上調(diào)，差異有顯著性（P＜0.05）（圖2）。

2.3 15-LOX對CASMC Kv2.1通道蛋白質(zhì)表達的影響 實驗重復(fù)8次（n=8），與正常細胞常氧組比較，缺氧組及15-LOX基因過表達細胞常氧組的Kv2.1蛋白質(zhì)表達均下調(diào)（P＜0.01）；而與正常細胞缺氧組比較，15-LOX基因敲除細胞缺氧組的Kv2.1蛋白質(zhì)表達則上調(diào)，差異有顯著性（P＜0.05）（圖3）。

3 討論

圖1 15-LOX對CASMC 15-HETE生成量的影響注：與A組比較：**P＜0.01；與B組比較：##P＜0.01；A：正常細胞常氧組（對照組）；B：正常細胞缺氧組；C：15-LOX基因過表達細胞常氧組；D：15-LOX基因敲除細胞缺氧組。15-LOX：15-脂加氧酶；CASMC：腦動脈平滑肌細胞；Kv：電壓依從性鉀通道；15-HETE：15-羥二十碳四烯酸

圖2 15-LOX對CASMC Kv2.1通道m(xù)RNA表達的影響注：與A組比較：**P＜0.01；與B組比較：#P＜0.05；A：正常細胞常氧組（對照組）；B：正常細胞缺氧組；C：15-LOX基因過表達細胞常氧組；D：15-LOX基因敲除細胞缺氧組。15-LOX：15-脂加氧酶；CASMC：腦動脈平滑肌細胞；mRNA：信使RNA

AA是人體內(nèi)最豐富、最活躍的一種多不飽和脂肪酸，15-HETE是AA經(jīng)15-LOX代謝生成的主要產(chǎn)物之一，在正常的鼠腦中僅有少量的15-HETE，而在缺氧時其含量則明顯增加[11]，這提示了15-HETE很可能參與了缺氧引起的一系列病理生理過程。在本課題組的前期研究中已經(jīng)證實：在缺氧狀態(tài)下，腦動脈平滑肌上的15-LOX表達增加，進而使15-HETE的生成量增加，并且15-HETE的生成可以被15-LOX抑制劑所抑制[11]；同時還發(fā)現(xiàn)15-HETE可以濃度依賴的方式引起離體頸內(nèi)動脈環(huán)收縮[12]。

有研究表明，頸動脈體Ⅰ型細胞的Kv通道在缺氧狀態(tài)下受到抑制[13]，提示Kv通道的抑制在缺氧誘導(dǎo)的腦動脈收縮中起重要作用。Han等[14]在肺動脈中的研究發(fā)現(xiàn)15-HETE通過阻滯肺動脈平滑肌細胞的Kv通道引起肺動脈平滑肌收縮。而本課題組的研究亦發(fā)現(xiàn)15-HETE可通過下調(diào)Kv通道（Kv1.5和Kv2.1）蛋白和mRNA的表達進而引起腦動脈平滑肌收縮[15-16]。因此，本研究假設(shè)在缺氧狀態(tài)下，15-LOX表達增加，15-HETE的生成量亦隨之增加，進而對Kv通道的抑制作用增強，最終導(dǎo)致腦動脈收縮。為了證實這一假設(shè)，本課題組選取了15-LOX作為關(guān)鍵點，對其進行干擾，然后觀察15-HETE生成量的變化及Kv通道的表達情況。

圖3 15-LOX對CASMC Kv2.1通道蛋白質(zhì)表達的影響注：與A組比較：**P＜0.01；與B組比較：#P＜0.05；A：正常細胞常氧組（對照組）；B：正常細胞缺氧組；C：15-LOX基因過表達細胞常氧組；D：15-LOX基因敲除細胞缺氧組。15-LOX：15-脂加氧酶；CASMC：腦動脈平滑肌細胞

本研究將CASMC分為4組，分別于常氧環(huán)境和缺氧環(huán)境下培養(yǎng)。與常氧環(huán)境相比，Kv2.1通道的表達可被缺氧和15-LOX的過表達所抑制，而當(dāng)15-LOX基因被敲除時，缺氧條件則不會抑制Kv2.1通道的表達。

腦動脈上至少存在4種不同類型的鉀通道，在本課題前期研究中，采用大鼠離體頸內(nèi)動脈環(huán)的方法已經(jīng)證實：缺氧主要通過抑制Kv通道引起頸內(nèi)動脈收縮[12]。在缺氧條件下15-LOX的表達增加可能促進了AA代謝生成15-HETE，而15-HETE在腦缺氧過程中有可能通過下調(diào)Kv通道增強腦動脈收縮，從而加重動脈狹窄。本研究證實了AA經(jīng)15-LOX代謝生成的產(chǎn)物15-HETE對Kv通道確實有抑制作用。

總之，本研究表明可通過降低15-HETE水平和防止Kv通道的下調(diào)為改善缺血性血管閉塞提供治療策略。同時，也提示15-LOX有望成為腦缺氧治療的新靶點。然而，缺氧時，15-HETE究竟是如何抑制Kv通道，最終引起腦動脈收縮的，這一機制尚未明確，這將是以后我們重點研究的內(nèi)容。

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【點睛】

在缺氧誘導(dǎo)的腦動脈收縮中，腦動脈平滑肌細胞上的15-LOX表達增加，15-HETE生成量增加，對Kv通道的抑制作用增強。