李海濤， 潘頻華

·綜述·

鮑曼不動(dòng)桿菌疫苗研究進(jìn)展

李海濤， 潘頻華

鮑曼不動(dòng)桿菌； 疫苗； 蛋白

鮑曼不動(dòng)桿菌存在于醫(yī)院環(huán)境并在患者多部位定植，導(dǎo)致醫(yī)院獲得性肺炎、血流感染、腹腔感染、腦膜炎、皮膚軟組織感染和泌尿系感染等［1］。由于其強(qiáng)大的獲得耐藥性及克隆傳播能力，鮑曼不動(dòng)桿菌已成為全球流行并呈高度耐藥的常見(jiàn)致病菌［2］。在我國(guó)，鮑曼不動(dòng)桿菌已經(jīng)成為醫(yī)院感染最常見(jiàn)的病原菌之一，2012年我國(guó)9省市15所教學(xué)醫(yī)院臨床檢出的革蘭陰性菌標(biāo)本中，鮑曼不動(dòng)桿菌達(dá)15.05%，僅次于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，其中大多數(shù)為多重耐藥菌［3］。在部分重癥監(jiān)護(hù)病房，多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌已居醫(yī)院感染的第1位［4］。需要警惕的是，耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌感染率持續(xù)上升，并逐漸成為最常見(jiàn)的基因表型［5-6］。由于鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性日趨嚴(yán)重，新的有效抗菌藥物研發(fā)遲滯，近年，國(guó)外許多學(xué)者嘗試通過(guò)研制針對(duì)性細(xì)菌疫苗的手段來(lái)防治鮑曼不動(dòng)桿菌，現(xiàn)就鮑曼不動(dòng)桿菌疫苗研制的新進(jìn)展綜述如下。

1 滅活疫苗

滅活全菌體（inactivated whole cell，IWC），作為最簡(jiǎn)單快捷的人工免疫方式，以滅活病原微生物制備抗原誘導(dǎo)免疫應(yīng)答預(yù)防感染是優(yōu)先考慮的方法。McConnell等［7］和Harris等［8］分別以腹腔接種和鼻內(nèi)接種方式構(gòu)建鮑曼不動(dòng)桿菌感染小鼠肺炎模型，并分別以ATCC 19606毒株和LAC-4毒株制備甲醛滅活全菌體疫苗并肌注免疫小鼠。在接種IWC的小鼠可以觀察到明顯的主動(dòng)免疫，表現(xiàn)為；①免疫后在小鼠體內(nèi)可以檢測(cè)到明顯的特異性抗體升高；②免疫小鼠組織細(xì)菌負(fù)荷量，及血清細(xì)胞因子明顯減少；③以不同鮑曼不動(dòng)桿菌毒株感染小鼠，IWC免疫組小鼠生存率接近100%，而未免疫組小鼠則不足20%。研究同樣表明，注射IWC抗血清后再感染鮑曼不動(dòng)桿菌小鼠未出現(xiàn)感染死亡，說(shuō)明IWC抗血清具有明顯的被動(dòng)免疫保護(hù)作用。IWC的主動(dòng)和被動(dòng)免疫均對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌感染有保護(hù)作用。KuoLee等［9］最近的研究指出，IWC滴鼻亦能誘導(dǎo)體液免疫的產(chǎn)生，但與黏膜免疫相關(guān)的sIgA并無(wú)明顯升高，且免疫血清無(wú)被動(dòng)免疫保護(hù)作用。IWC雖然有明顯的主動(dòng)及被動(dòng)免疫保護(hù)作用，但問(wèn)題也很明顯；①IWC免疫原性不強(qiáng)，需大劑量多次接種；②IWC在制作過(guò)程中可能出現(xiàn)導(dǎo)致滅活不完全，接種免疫后危及患者生命；③IWC無(wú)效成分過(guò)多，其中內(nèi)毒素可能加重患者病情。

2 外膜蛋白疫苗

2.1 外膜復(fù)合物（outer membrane complex，OMC）

為解決以上問(wèn)題，McConnell等［10］進(jìn)一步提出OMC可能成為一個(gè)較為安全的鮑曼不動(dòng)桿菌候選疫苗。OMC為超速離心提取自鮑曼不動(dòng)桿菌外膜，其包含細(xì)胞膜上多個(gè)蛋白質(zhì)成分，具有一定的免疫原性。選擇ATCC 19606毒株提取OMC，免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)；①單次免疫效果良好，能誘導(dǎo)小鼠體液免疫及細(xì)胞免疫（反映指標(biāo)為IgG及INF-α明顯升高）；②降低小鼠感染后組織細(xì)菌負(fù)荷量及炎性因子水平；③OMC能保護(hù)小鼠免于鮑曼不動(dòng)桿菌致死感染；④小鼠OMC抗血清保護(hù)小鼠免于鮑曼不動(dòng)桿菌感染引起膿毒癥所致死亡，有明顯的被動(dòng)免疫保護(hù)作用。該研究結(jié)果與IWC研究結(jié)果［7］高度一致，從安全性考慮而言，OMC較IWC為優(yōu)。

2.2 外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMV）

OMV是由革蘭陰性菌外膜外翻分泌形成，其中包裹了大量的外膜蛋白、間質(zhì)蛋白和脂多糖。Bomberger等［11］的研究表明，由于OMV能與宿主細(xì)胞外膜融合，提示OMV可能遠(yuǎn)距離輸送細(xì)菌產(chǎn)物，也解釋其群體感應(yīng)（quorum sensing）、毒力因子傳播、基因-基因轉(zhuǎn)換等作用，表明在細(xì)菌致病過(guò)程中OMV發(fā)揮了重要作用。McConnell等［12］研究提示，OMV同樣也能成為鮑曼不動(dòng)桿菌候選疫苗。其作為候選疫苗優(yōu)勢(shì)在于；①OMV中內(nèi)毒素水平可控制在（1.3 ±0.01）×105EU/μg，較IWC和OMC明顯降低；②OMV接種后同樣引起小鼠體液免疫應(yīng)答，而且二次強(qiáng)化免疫后能明顯增加特異性IgG和IgM水平；③OMV接種后降低了小鼠感染后組織細(xì)菌負(fù)荷量及炎性因子水平（IL-1β、IL-6）；④OMV誘導(dǎo)保護(hù)性免疫，明顯降低了鮑曼不動(dòng)桿菌膿毒癥小鼠模型死亡率。另外，OMV制備只需過(guò)濾鮑曼不動(dòng)桿菌上清液并加以濃縮便可，方法簡(jiǎn)單而快速。但OMV抗血清沒(méi)有被動(dòng)免疫保護(hù)作用；通常對(duì)來(lái)自所提取的單克隆特異性毒株免疫效果最佳，因而，可能更適用鮑曼不動(dòng)桿菌感染暴發(fā)時(shí)快速制備OMV預(yù)防新的感染；雖然OMV內(nèi)毒素水平低于IWC和OMC，但仍然超過(guò)了人體所能承受的水平。

IWC、OMC和OMV均屬于多抗原成分，其優(yōu)勢(shì)在于能有效地避免因多克隆毒株的存在使得疫苗效果降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的其他血清型所致膿毒癥感染也有保護(hù)作用［7-8，10，12］，原因可能是多抗原成分發(fā)揮的交叉免疫作用，也可能是其中存在高度保守基因所編碼的抗原成分；其缺點(diǎn)同樣明顯；由于其所含成分繁多且復(fù)雜，在生產(chǎn)過(guò)程中難以標(biāo)準(zhǔn)化疫苗劑量；而且其中脂多糖（內(nèi)毒素）含量超過(guò)了人體所能承受的上限，限制了在人體中的應(yīng)用?；蛟S通過(guò)滅活鮑曼不動(dòng)桿菌中編碼脂多糖合成途徑的相關(guān)基因，獲得相應(yīng)疫苗是減低內(nèi)毒素水平的可行方式之一。

3 重組蛋白疫苗

3.1 生物膜相關(guān)蛋白（biofilm associated protein，Bap）

由于IWC、OMC和OMV在臨床應(yīng)用推廣受限以及對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌研究的深入，成分單一、免疫原性強(qiáng)的亞單位蛋白疫苗成為研究熱點(diǎn)。Bap是一種特異的細(xì)胞表面蛋白，與鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜早期形成及成熟相關(guān)，在細(xì)菌感染過(guò)程中起重要作用。Fattahian等［13］以重組亞單位Bap免疫小鼠3次，ELISA證實(shí)了小鼠體內(nèi)產(chǎn)生對(duì)Bap的體液免疫，Bap特異性IgG抗體效價(jià)較對(duì)照組明顯升高；免疫后小鼠在接種半數(shù)致死劑量細(xì)菌（107）18 h后組織細(xì)菌計(jì)數(shù)明顯減少，而未免疫小鼠此時(shí)均已死亡，提示Bap能有效降低小鼠免于鮑曼不動(dòng)桿菌膿毒癥感染所致死亡的風(fēng)險(xiǎn)。Bap作為傳統(tǒng)疫苗的免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)是保守的，在不同毒株中存在相同的免疫表型（Bap誘導(dǎo)抗體對(duì)Kh0058、Kh0059、Kh0097、Kh0099等毒株均有效），使得Bap作為疫苗能對(duì)抗多個(gè)鮑曼不動(dòng)桿菌克隆毒株。但抗Bap血清不能發(fā)揮被動(dòng)免疫保護(hù)功能。

3.2 外膜蛋白A（outer membrane protein，Omp A）

OmpA是目前明確的毒力因子，在鮑曼不動(dòng)桿菌外膜中含量豐富［14］，且在不同鮑曼不動(dòng)桿菌毒株中氨基酸序列高度保守，PubMed BLAST檢索結(jié)果證實(shí)其人類蛋白組學(xué)同源性最小，避免誘發(fā)產(chǎn)生自身抗體的可能。Luo等［15］以重組Omp A（rOmpA）免疫糖尿病小鼠后發(fā)現(xiàn)；①rOmp A誘發(fā)了明顯的體液免疫，表現(xiàn)為抗rOmp A抗體效價(jià)明顯增高，小鼠28 d生存率由0提高到50%左右，且rOmp A抗體效價(jià)與小鼠的存活率呈正相關(guān)；②同時(shí)明顯降低腦、腎、肝、脾組織細(xì)菌負(fù)荷量（但肺組織中細(xì)菌負(fù)荷量的下降無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。另外，作者亦研究了rOmp A抗血清的免疫治療作用，雖然免疫血清不能增強(qiáng)補(bǔ)體介導(dǎo)的殺菌作用，但rOmp A抗體能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞調(diào)理吞噬殺傷鮑曼不動(dòng)桿菌，從而發(fā)揮免疫調(diào)理作用。鮑曼不動(dòng)桿菌菌落培養(yǎng)上清液所獲得的OmpA是水溶性并具有生物活性，但原核表達(dá)rOmp A則不溶于水［16］，因此在其表達(dá)上仍需進(jìn)一步研究。

3.3 三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（trimeric autotransporter protein Ata）

Ata，一種鮑曼不動(dòng)桿菌表面蛋白成分，附著于許多細(xì)胞外基質(zhì)或基膜蛋白，是形成致病力、生物菌膜及對(duì)Ⅳ型膠原纖維黏附所必需［17］。Bentancor等［18］的研究顯示；①Ata抗體可以阻礙鮑曼不動(dòng)桿菌黏附Ⅳ型膠原纖維，從而減低鮑曼不動(dòng)桿菌致病力；②Ata抗體不但可以促進(jìn)多核中性粒細(xì)胞（PMNs）調(diào)理吞噬殺傷鮑曼不動(dòng)桿菌，還能介導(dǎo)補(bǔ)體依賴的殺菌作用；③抗Ata血清可以降低小鼠感染后組織細(xì)菌負(fù)荷量，提示Ata是一個(gè)保護(hù)性免疫的重要靶點(diǎn)。

Bap、Omp A、Ata均為保守基因表達(dá)產(chǎn)物，具有高度同源性，并覆蓋了較大部分的鮑曼不動(dòng)桿菌毒株，表現(xiàn)了良好的免疫效果，是潛在疫苗候選抗原?；蚬こ讨亟M技術(shù)生產(chǎn)疫苗具有成分單一、重復(fù)性好、產(chǎn)品批間差異小、易于控制細(xì)菌內(nèi)毒素含量等優(yōu)勢(shì)，不存在疫苗劑量定量的困擾，是現(xiàn)代疫苗開(kāi)發(fā)的重要方向之一。但單一成分疫苗可能免疫保護(hù)不足，或者將鮑曼不動(dòng)桿菌置于強(qiáng)大的選擇壓力下誘導(dǎo)細(xì)胞膜靶向蛋白下調(diào)，出現(xiàn)免疫逃避導(dǎo)致疫苗最終失效。因此，篩選保守性好、免疫原性強(qiáng)的抗原，以便進(jìn)行多抗原組合，是研制重組蛋白疫苗需重點(diǎn)解決的問(wèn)題。

4 多糖疫苗

4.1 多聚-N-乙酰β葡聚糖（Poly-N-acetyl-βglucan，PNAG）

PNAG是一種表達(dá)于多株臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌表面的多糖，在體外生物膜的形成發(fā)揮了重要作用［19］。由于PNAG抗原性弱，Bentancor等［20］將合成PNAG與破傷風(fēng)類毒素偶聯(lián)形成結(jié)合疫苗后，免疫兔并提取抗PNAG血清，被動(dòng)免疫小鼠發(fā)現(xiàn)；①PNAG抗體可以高效介導(dǎo)多形核中性粒細(xì)胞（PMNs）的調(diào)理殺菌作用；②被動(dòng)免疫后感染鮑曼不動(dòng)桿菌的小鼠組織細(xì)菌負(fù)荷量明顯降低，發(fā)揮了保護(hù)性抗體作用。提示PNAG是一種潛在的候選疫苗抗原，有可能在主動(dòng)免疫和被動(dòng)免疫中發(fā)揮保護(hù)作用。

4.2 K1莢膜多糖

鮑曼不動(dòng)桿菌細(xì)胞膜外還表達(dá)多種莢膜多糖，其中K1莢膜多糖與鮑曼不動(dòng)桿菌的毒力密切相關(guān)，且不會(huì)誘導(dǎo)人體產(chǎn)生自身免疫［21-22］。Russo等［23］通過(guò)純化的K1莢膜多糖免疫小鼠并獲得抗K1莢膜多糖血清以驗(yàn)證其被動(dòng)免疫效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在體外實(shí)驗(yàn)中抗血清可以增強(qiáng)PMNs介導(dǎo)的調(diào)理吞噬作用，增強(qiáng)細(xì)菌清除率。但是，只有13%鮑曼不動(dòng)桿菌為K1血清型，因此，K1莢膜多糖疫苗只適用于特定毒株，不能發(fā)揮有效的預(yù)防感染作用。

莢膜多糖主要誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生調(diào)理作用殺傷鮑曼不動(dòng)桿菌，相比較抗原性較弱，且保守性欠佳，并不是疫苗制備的最佳選擇，但豐富了疫苗選擇的思路。

幾乎所有成功的疫苗，人們均熟知自然免疫對(duì)抗感染的全過(guò)程，并盡量模仿其保護(hù)性免疫反應(yīng)。雖然目前鮑曼不動(dòng)桿菌疫苗的研究取得了一定的進(jìn)展，但許多技術(shù)依然陳舊，已不能滿足新疫苗開(kāi)發(fā)的要求。近年來(lái)，逆向免疫學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)的興起為疫苗制備指明了新的道路，通過(guò)對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌保守位點(diǎn)的定位和基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)，國(guó)外學(xué)者從理論上篩選出多種鮑曼不動(dòng)桿菌候選疫苗抗原［24］，Omp A、Bap亦位列其中。由于鮑曼不動(dòng)桿菌基因組表達(dá)的多樣性及不穩(wěn)定性，多個(gè)亞單位的組合疫苗或許是未來(lái)鮑曼不動(dòng)桿菌疫苗研究的重要方向。同時(shí)，目前已明確的抗體在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了良好的保護(hù)作用，開(kāi)發(fā)特異性免疫球蛋白制劑甚至單克隆抗體制劑用于治療的被動(dòng)免疫方法或?qū)⒊蔀檠芯糠较蛑弧?/p>

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Research progress of the vaccine against Acinetobacter baumannii

LI Haitao，PAN Pinhua.（Department of Respiratory and Critical Care Medicine，Central South University Xiangya Hospital，Changsha 410008，China）

R378

A

1009-7708（2015）02-0188-04

2014-05-20

2014-07-24

湖南省科技廳社會(huì)發(fā)展支撐課題（2013SK3023）。

中南大學(xué)湘雅醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，長(zhǎng)沙410008。

李海濤（1989—），男，碩士，醫(yī)師，主要從事肺部重癥感染診治研究。

潘頻華，E-mail；pinhuapan668?hotmail.com。