林仙軍，羅成江，王 侃，張航俊(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，浙江杭州310020)

專(zhuān)題論述

色譜法在飼料檸檬酸檢測(cè)中的應(yīng)用

林仙軍，羅成江，王 侃，張航俊
(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，浙江杭州310020)

檸檬酸是有機(jī)酸中的第一大酸，又名拘櫞酸，分子式C6H8O7H2O，安全無(wú)毒，能被生物體直接代謝吸收［1］，作為飼料添加劑可提高飼料的適口性［2］，降低pH值，激活機(jī)體腸胃內(nèi)的消化酶，提高飼料轉(zhuǎn)化率，增強(qiáng)機(jī)體抗病力［3］，還可作為防霉劑和抗氧化劑保證飼料品質(zhì)［4］。

本文主要對(duì)飼料中檸檬酸的檢測(cè)方法作一簡(jiǎn)要綜述，供參考。

1 高效液相色譜法(HPLC)

HPLC法是目前應(yīng)用最多的色譜分析方法，由輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器和記錄器等組成，具有速度快、分辨率及靈敏度高、色譜柱可反復(fù)使用、樣品量少且易回收等優(yōu)點(diǎn)［5］，利用HPLC法對(duì)飼料中的檸檬酸進(jìn)行測(cè)定，可以避免色素和雜質(zhì)影響，測(cè)定方法簡(jiǎn)便，快速準(zhǔn)確。

索德成等(2012)［6］利用HPLC法同時(shí)測(cè)定飼用酸化劑中甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、檸檬酸含量。采用Grom-Sil org acid柱(250 mm×2.1 mm，5μm)分析。流動(dòng)相為pH值2.5磷酸水溶液;流速1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm;柱溫30℃。在該色譜條件下，5種有機(jī)酸分離良好。平均回收率均大于85%，RSD小于10.0%。檢測(cè)結(jié)果表明該法操作簡(jiǎn)便易行，準(zhǔn)確可靠。鄭婷等(2009)［7］建立了測(cè)定飼料添加劑中主要有機(jī)酸-甲酸、乳酸、檸檬酸含量的HPLC分析法。色譜條件為Agilent ZORBAX SB-AQ 5μm(4.6 mm×250 mm)分析柱，流動(dòng)相為0.1 mol/L磷酸二氫鈉緩沖溶液(pH=2)∶乙腈=98∶2，流速0.8 mL/min，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，在200～4000 mg/L濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，加標(biāo)回收率98%～104%。謝明等(2004)［8］應(yīng)用反相液相色譜法同時(shí)分析測(cè)定飼料有機(jī)酸化劑中乙酸和檸檬酸的化學(xué)含量。結(jié)果表明，檸檬酸變異系數(shù)不超過(guò)3%，回收率92%～96%，測(cè)定具有較高的準(zhǔn)確性和精確度。

HPLC法分析速度較快、靈敏度較高，但樣品預(yù)處理操作比較繁瑣，測(cè)定周期較長(zhǎng)、成本較高、測(cè)定后需清除殘留樣品，若能與其他技術(shù)聯(lián)用，縮短檢測(cè)周期、降低測(cè)定成本，則在檢測(cè)飼料檸檬酸中將有更大進(jìn)展。

2 離子色譜法(IC)

IC法是一種分析檸檬酸的有效方法，可按分離原理分為離子交換色譜法(IEC)和離子排斥色譜法(ICE)。IEC法的原理是樹(shù)脂上可電離離子與流動(dòng)相中具有相同電荷離子及被測(cè)組分的離子進(jìn)行可逆交換，根據(jù)各離子與離子交換基團(tuán)具有不同的電荷吸引力而分離［5］。

該法主要用于分析有機(jī)酸、氨基酸、多肽及核酸，在分離低分子有機(jī)酸方面，無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理，能很好分離和同時(shí)檢測(cè)多種有機(jī)酸，是分析低相對(duì)分子質(zhì)量有機(jī)酸的有效方法。ICE法分析有機(jī)酸主要有以下優(yōu)點(diǎn):一是適合于含水基體;二是對(duì)強(qiáng)親水性物質(zhì)不會(huì)造成損失;三是只需簡(jiǎn)單的樣品前處理，不需柱前衍生處理;四是有機(jī)酸分析幾乎不受無(wú)機(jī)陰離子干擾。

劉霞等(2009)［9］建立了同時(shí)測(cè)定飼料添加劑中甲酸、乳酸、檸檬酸及磷酸的IC法。樣品采用酸堿結(jié)合的預(yù)處理方法提取飼料添加劑中的4種有機(jī)酸。色譜條件為RFC-30KOH淋洗液發(fā)生器、AS11-HC離子色譜柱，抑制電導(dǎo)檢測(cè)。此法各種有機(jī)酸和無(wú)機(jī)酸線性關(guān)系良好(相關(guān)系數(shù)為0.9995～0.9998)，線性范圍為1～20 mg/L，回收率為98%～100%，分析方法快速簡(jiǎn)便。

雖然IC法已應(yīng)用于飼料中檸檬酸的測(cè)定，但因淋洗液和柱填料的特殊性，對(duì)樣品中蛋白質(zhì)含量有嚴(yán)格限定，不適于復(fù)雜樣品分析，且柱子容量較小，進(jìn)樣量不宜太多。因此，對(duì)于含有復(fù)雜成分的飼料，不適合用該法檢測(cè)檸檬酸含量。

3 氣相色譜法(GC)

GC法的原理是根據(jù)物質(zhì)的物理性質(zhì)不同，試樣中氣相和固定液液相間的分配系數(shù)不同，當(dāng)汽化后的試樣被載氣帶入色譜柱中運(yùn)行時(shí)，組份就在其中的兩相間進(jìn)行反復(fù)多次分配，由于固定相對(duì)各組份的吸附或溶解度不同，從而達(dá)到分離目的。

該法主要適用于氣體物質(zhì)或可在一定溫度下轉(zhuǎn)化為氣體的物質(zhì)，GC法與不同檢測(cè)器的聯(lián)用，大大提高了其檢測(cè)靈敏度，其中GC法和質(zhì)譜法聯(lián)用(GC-MS)已成為具有高分離能力、高靈敏度、高分析速度和高鑒定能力的分離檢測(cè)技術(shù)，是目前低分子有機(jī)酸檢測(cè)中最常用和最精密的方法。但因不易揮發(fā)或熱不穩(wěn)定酸類(lèi)在進(jìn)樣前需經(jīng)衍生化反應(yīng)，導(dǎo)致樣品前處理比較困難且費(fèi)時(shí)，成為GC法檢測(cè)有機(jī)酸的瓶頸所在。

黃建立(2005)［10］建立了同時(shí)測(cè)定飼料添加劑中乳酸、檸檬酸的毛細(xì)管GC分析法。樣品添加內(nèi)標(biāo)酒石酸后，用N，O一雙(三甲基硅烷)乙酰胺(BSA)硅烷化，經(jīng)SE-30毛細(xì)管柱色譜分離，氫火焰離子化檢測(cè)器檢測(cè)并對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行分析。乳酸和檸檬酸的回收率分別為97.5%、97.3%。任清(2002)［11］建立了飼料添加劑中富馬酸、乳酸、檸檬酸同時(shí)測(cè)定的毛細(xì)管GC分析法。樣品添加內(nèi)標(biāo)酒石酸后，用N，O-雙(三甲基硅烷基)乙酰胺(BSA)硅烷化，經(jīng)SE-30毛細(xì)管柱色譜分離，氫火焰離子化檢測(cè)器檢測(cè)。富馬酸、乳酸和檸檬酸的回收率分別為97.4%、97.2%和96.8%。

飼料中檸檬酸的測(cè)定方法很多，但各有適用范圍與優(yōu)缺點(diǎn)。選擇合適的提取分離及分析測(cè)定方法，除需考慮所測(cè)飼料的結(jié)構(gòu)性質(zhì)外，還要考慮其成分對(duì)檸檬酸的干擾。

目前，色譜法作為基本分析方法，已經(jīng)成為測(cè)定飼料中檸檬酸的主要方法。檢測(cè)器、色譜柱聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)的發(fā)展，解決了傳統(tǒng)液相檢測(cè)器靈敏度和選擇性不夠的缺點(diǎn)，提供了可靠、精確的相對(duì)分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)信息，簡(jiǎn)化了試驗(yàn)步驟，節(jié)省了樣品準(zhǔn)備時(shí)間和分析時(shí)間，因此是對(duì)飼料生產(chǎn)進(jìn)行監(jiān)控的有效檢測(cè)手段之一。

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2014-07-11