孫舒然，朱萬龍，陳金龍，曹 能，高文榮，左木林，葉芳艷，付家豪，楊 濤，王政昆

（1.云南省高校西南山地生態(tài)系統(tǒng)動植物生態(tài)適應(yīng)進(jìn)化及保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650500；2.昆明市海口林場，昆明 650114）

冷馴化條件下中緬樹鼩脂肪組織切片的對比

孫舒然1，朱萬龍1，陳金龍2，曹 能1，高文榮1，左木林1，葉芳艷1，付家豪1，楊 濤1，王政昆1

（1.云南省高校西南山地生態(tài)系統(tǒng)動植物生態(tài)適應(yīng)進(jìn)化及保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650500；2.昆明市?？诹謭觯ッ?650114）

目的探討冷馴化不同時期中緬樹鼩脂肪細(xì)胞形態(tài)變化，為冷馴化是否可以誘導(dǎo)白色脂肪組織中米色脂肪細(xì)胞（beige adipocytes）的產(chǎn)生提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。方法通過蘇木素-伊紅染色切片、免疫組織化學(xué)染色切片、免疫熒光染色切片進(jìn)行對比。結(jié)果隨著冷馴化時間延長，白色脂肪細(xì)胞和褐色脂肪細(xì)胞形態(tài)都明顯變小，且褐色脂肪組織中解偶聯(lián)蛋白1（uncoupling protein 1，UCP1）表達(dá)增加，同時腹部皮下白色脂肪組織中可能已發(fā)生褐變，產(chǎn)生一些具有UCP1表達(dá)的淺褐色脂肪細(xì)胞，即米色脂肪細(xì)胞。結(jié)論不同染色切片不僅能夠清晰觀察到脂肪細(xì)胞的形態(tài)改變，還能從抗體陽性顏色中觀察出UCP1表達(dá)變化，為中緬樹鼩脂肪組織研究提供基礎(chǔ)性材料。

冷馴化；脂肪組織；蘇木素-伊紅切片；免疫組織化學(xué)切片；免疫熒光切片

哺乳動物體內(nèi)的脂肪組織主要分為白色脂肪組織（white adipose tissue，WAT）和褐色脂肪組織（brown adipose tissue，BAT）［1］。白色脂肪組織由白色脂肪細(xì)胞構(gòu)成，其細(xì)胞內(nèi)含有一較大脂滴，成單室性，線粒體含量較少。WAT主要以甘油三酯的形式儲能，皮下和內(nèi)臟脂肪為主要貯存能量部位。BAT主要由褐色脂肪細(xì)胞構(gòu)成，其細(xì)胞內(nèi)含有多個小脂滴，成多腔室，線粒體含量較多且特異性表達(dá)解偶聯(lián)蛋白1（uncoupling protein 1，UCP1）。BAT通過線粒體內(nèi)膜上的UCP1將脂肪酸氧化與ATP產(chǎn)生解偶聯(lián)，把能量直接以熱量的形式散失增加能量消耗。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，動物實(shí)驗(yàn)表明BAT具有抵抗肥胖的作用［2］。2009年《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》中發(fā)表了系列文章不僅證實(shí)健康成人體內(nèi)存在著具有功能的褐色脂肪組織［3-5］，而且還證明冷暴露可以激活人體BAT的產(chǎn)熱活性［6］。不僅如此，許多研究也同樣發(fā)現(xiàn)，在冷刺激和某些藥物的誘導(dǎo)下，WAT中會出現(xiàn)一種特殊的米色脂肪細(xì)胞，這種米色脂肪細(xì)胞具有多腔室的脂滴，富含線粒體，且表達(dá)褐色脂肪細(xì)胞特有標(biāo)記物UCP1［7-8］。這一研究的發(fā)現(xiàn)為防治人類肥胖提供了一種極為重要的新方向，同時使BAT作為防治肥胖等疾病的靶器官受到研究者的廣泛關(guān)注。

中緬樹鼩（Tupaia belangeri）屬于攀鼩目（Scadentia）樹鼩科（Tupaiidae），主要分布于南亞和東南亞，為東洋界特有的小型哺乳動物?，F(xiàn)生攀鼩目只有一個科即樹鼩科，我國僅有中緬樹鼩一種。主要分布于云南、貴州、廣西、四川西部及海南島等地［9］。樹鼩與靈長類動物親緣關(guān)系較近，具有特殊的進(jìn)化地位，具有十分廣泛的開發(fā)應(yīng)用前景。而以樹鼩為實(shí)驗(yàn)動物的肥胖模型的建立，在生物醫(yī)學(xué)上可以作為人類代謝疾病的良好動物模型。但目前有關(guān)中緬樹鼩BAT及WAT的組織結(jié)構(gòu)和組織特征尚未見報道，缺少相應(yīng)的基礎(chǔ)材料。

本研究選取中緬樹鼩作為實(shí)驗(yàn)動物，利用蘇木素-伊紅切片（hematoxylin-eosin staining sections）、免疫組織化學(xué)切片（immunohistochemical staining sections）、免疫熒光切片（immunofluorescence staining sections），觀察冷馴化是否可以使白色脂肪細(xì)胞和褐色脂肪細(xì)胞形態(tài)存在可塑性轉(zhuǎn)變，并且通過切片尋找米色脂肪細(xì)胞出現(xiàn)的可能形態(tài)。為中緬樹鼩BAT研究提供形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)材料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)動物由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所靈長類研究中心提供【SCXK（滇）2013-0001】，帶回云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動物飼養(yǎng)房飼養(yǎng)【SYXK（滇）2013-0001】，22℃～25℃室溫，光照12L∶12D條件下適應(yīng)14d，此為冷馴化0d對照組。冷馴化28d、49d共兩組，每組10只動物，在環(huán)境溫度5±1℃、光照12L∶12D、無巢材條件下單籠飼養(yǎng)。每天兩次定點(diǎn)喂以由玉米面、奶粉、白糖以90％∶5％∶5％比例混合制得的熟食，少許水，并適量添加蘋果，面包蟲等。實(shí)驗(yàn)動物均為非繁殖期成年個體且體重差異不顯著，實(shí)驗(yàn)組與對照組中雌雄各半。

1.2 脂肪組織的獲取

將對照組、冷馴化28d、49d組的中緬樹鼩斷頸處死。無菌操作取下樹鼩腋下褐色脂肪組織、腹部皮下脂肪組織進(jìn)行石蠟包埋，為后續(xù)切片做準(zhǔn)備。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑

封閉用正常羊血清、PV9000通用二抗試劑盒、DAB顯色試劑盒、抗淬滅封片劑（含DAPI）均購自北京中杉金橋生物有限公司。TritonX-100、Tween 20購自Sigma-vetec。HE染色試劑盒購于北京索萊寶生物有限公司。

免疫組化與免疫熒光所用UCP1抗體均購于Abcam公司。

1.4 蘇木素-伊紅染色切片的制備

切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟、水化。用0.01mol/L PBS和蒸餾水分別漂洗3次，每次5min。加入HE染色試劑盒中的蘇木素，室溫孵育2min。蒸餾水洗去浮色，用試劑盒中的分化液，密切觀察分色情況。蒸餾水漂洗3次每次3min。加入試劑盒中的伊紅染液，孵育1min。蒸餾水洗去浮色，繼續(xù)用蒸餾水漂洗10min。梯度酒精脫水（75％→80％→90％→90％→100％→100％，各5min），二甲苯透明30min，中性樹膠封片，待晾干后，光學(xué)顯微鏡下拍照。

1.5 免疫組織化學(xué)染色切片的制備

切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟、水化。用0.01mol/L PBS漂洗3次，每次5min。加入3％過氧化氫覆蓋切片，室溫避光孵育30min。0.01mol/L PBS漂洗3次每次5min。用濾紙將切片周圍的水分吸干后，用組化筆在切片周圍畫圓圈，防止后續(xù)染色過程中液體漏出。5％羊血清室溫封閉60min。甩去多余的封閉液，加合適濃度的第一抗體（UCP1抗體），4℃冰箱過夜。0.01mol/L PBST漂洗3次每次5min。加入PV9000試劑盒中的試劑I，37℃孵育30min。0.01mol/L PBST漂洗3次每次5min。加入PV9000試劑盒中的試劑II，37℃孵育30min。0.01mol/L PBST漂洗3次每次5min。將DAB試劑盒中的濃縮液50uL加入1mL的稀釋液中，混勻備用。吸取切片上多余的水滴，每張組織片上滴加100uL的DAB顯色液，室溫下避光反應(yīng)5min，單蒸水終止顯色。梯度酒精脫水（75％→80％→90％→90％→100％→100％，各5min），二甲苯透明30min，中性樹膠封片，待晾干后，光學(xué)顯微鏡下拍照。

1.6 免疫熒光染色切片的制備

（1）切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟、水化。0.01mol/L PBS漂洗3次每次5min。蒸餾水漂洗3次每次5min。加入HE染色試劑盒中的蘇木素，室溫孵育2min。蒸餾水洗去浮色，用試劑盒中的分化液，密切觀察分色情況。蒸餾水漂洗3次每次3min。加入試劑盒中的伊紅染液，室溫孵育1min。蒸餾水洗去浮色，繼續(xù)用蒸餾水漂洗10min。梯度酒精脫水（75％→80％→90％→90％→100％→100％，各5min），二甲苯透明30min，中性樹膠封片，待晾干后，光學(xué)顯微鏡下拍照。

2 結(jié)果

2.1 蘇木素―伊紅染色切片

冷馴化0d、28d、49d中緬樹鼩腋下BAT的HE染色切片形態(tài)學(xué)變化顯著。從切片中可以發(fā)現(xiàn)（彩插2圖1），隨著冷馴化時間延長，中緬樹鼩腋下褐色脂肪細(xì)胞中脂肪滴逐漸變小。對照組腋下褐色脂肪組織中存在比較大的脂肪滴。冷馴化28d后，脂滴直徑明顯變小，較大的脂肪滴逐漸消失。而在冷馴化49d時，褐色脂肪細(xì)胞脂滴比馴化28d明顯變小，且分布在血管周圍的褐色脂肪細(xì)胞脂滴相對更小。

中緬樹鼩腹部皮下典型WAT中脂肪滴也發(fā)生顯著變化。冷馴化0d時為典型的單泡脂肪細(xì)胞，細(xì)胞中央有一大脂滴，細(xì)胞核被擠到邊緣，細(xì)胞呈空泡狀。冷馴化28d后，在單泡脂肪細(xì)胞中分化出部分具有小脂滴的多泡脂肪細(xì)胞。而在冷馴化49d時，更多具有小脂滴的多泡脂肪細(xì)胞出現(xiàn)。這說明冷馴化不僅使褐色脂肪細(xì)胞在形態(tài)上發(fā)生改變，也改變了白色脂肪細(xì)胞的形態(tài)。

2.2 免疫組織化學(xué)切片

在用UCP1抗體染色的免疫組織化學(xué)切片（彩插2圖2）中可以觀察到，對照組中緬樹鼩腋下BAT中UCP1表達(dá)的黃褐色區(qū)域較少，隨著冷馴化時間的延長，同一組織部位的UCP1陽性黃褐色面積增大，且顏色加深，說明經(jīng)冷馴化后UCP1表達(dá)量可能增加。同時在冷馴化28d時，BAT中血管周圍的黃褐色顏色明顯更深，說明在冷馴化時中緬樹鼩可通過增加典型BAT中UCP1的表達(dá)來增加產(chǎn)熱，并通過毛細(xì)血管的運(yùn)輸為機(jī)體提供熱量，以應(yīng)對冷脅迫。經(jīng)過冷馴化，褐色脂肪細(xì)胞中脂滴也逐漸變小，與HE染色切片的結(jié)果相同。

隨著冷馴化時間的延長，冷馴化組28d、49d樹鼩腹部大網(wǎng)膜上的白色脂肪細(xì)胞皆出現(xiàn)了分化，不僅脂滴變小，而且出現(xiàn)了UCP1陽性區(qū)域，顯示出褐色脂肪細(xì)胞的一定特征。冷馴化很有可能使得介于褐色脂肪細(xì)胞與白色脂肪細(xì)胞特征兩者之間的米色脂肪細(xì)胞出現(xiàn)。

2.3 免疫熒光染色切片

在以UCP1為一抗的免疫組織熒光染色切片中（彩插3圖3），對照組BAT中UCP1陽性紅色熒光較少且暗淡，而冷馴化組28d、49d腋下BAT中的UCP1陽性熒光更亮，且可以看到一些陽性熒光的橢圓點(diǎn)，很可能是線粒體。這說明冷馴化使得中緬樹鼩BAT中UCP1表達(dá)增加，與免疫組織化學(xué)染色結(jié)果一致。

冷馴化組49d腹部大網(wǎng)膜的WAT中發(fā)現(xiàn)一些UCP1陽性紅色熒光的橢圓點(diǎn)，很有可能是線粒體中UCP1的表達(dá)，這些細(xì)胞很有可能是冷馴化誘導(dǎo)的米色脂肪細(xì)胞。結(jié)果與免疫組織化學(xué)切片相同。

3 討論

近年來，對于認(rèn)識并挖掘BAT在肥胖防制中的應(yīng)用價值成為防治人類代謝疾病研究的一大熱點(diǎn)。Wouter等［7］的研究發(fā)現(xiàn)在冷刺激下，24位健康成年人中有23位褐色脂肪組織活性被激活，且較肥胖個體的褐色脂肪組織活性顯著低于較瘦個體。體質(zhì)指數(shù)與體重百分比與褐色脂肪組織活性成顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，而靜止代謝率與之成顯著正相關(guān)關(guān)系。Masayuki［10］研究同樣發(fā)現(xiàn)冷刺激（19℃）2h后，32位健康成年人（23～35歲）中有17位的鎖骨及脊椎區(qū)域吸收了大量的18氟-氟化脫氧葡萄糖（2-fluoro-2-deoxy-D-glucose，18F-FDG），而這些部位已在組織學(xué)上證明是BAT部位。而且冬季的褐色組織活性顯著高于夏季。在對中緬樹鼩的研究中同樣有所報道。根據(jù)張鱗等［11］的研究發(fā)現(xiàn)，冷馴化28d，BAT中的UCP1含量逐漸增加，且在21d時達(dá)到極顯著水平。而朱萬龍等人的報道也有相似的結(jié)果，隨著冷馴化時間的延長，樹鼩的靜止代謝率和非顫抖性產(chǎn)熱都明顯呈上升趨勢［12］。冬季的靜止代謝率和非顫抖性產(chǎn)熱顯著高于夏季［13］。與袁方等［14-15］的報道相一致。

本文通過三種切片對冷馴化不同時期的中緬樹鼩脂肪細(xì)胞形態(tài)變化對比發(fā)現(xiàn)，冷馴化可以誘導(dǎo)白色脂肪細(xì)胞和褐色脂肪細(xì)胞的形態(tài)改變。并且WAT中可能已發(fā)生褐變，產(chǎn)生一些具有UCP1表達(dá)的淺褐色褐色脂肪細(xì)胞，即米色脂肪細(xì)胞。從BAT切片的UCP1陽性表達(dá)不僅在免疫組織化學(xué)染色中顏色隨冷馴化時間逐漸加深，和在免疫組織熒光染色中熒光顏色逐步變亮中可以看出，冷馴化使得BAT中UCP1表達(dá)增加，這以以前的研究結(jié)果相一致。而在WAT切片中隨著冷馴化時間延長，切片中出現(xiàn)米色脂肪細(xì)胞說明，UCP1在典型的白色脂肪組織部位出現(xiàn)，增加了其適應(yīng)性產(chǎn)熱，使樹鼩在維持體溫應(yīng)對冷脅迫時做出一定貢獻(xiàn)。

但目前關(guān)于白色脂肪組織褐變的機(jī)制還未清楚。Khanh等［16］通過脂肪組織的超微結(jié)構(gòu)、脂肪細(xì)胞分化時的分子標(biāo)記物以及流式細(xì)胞對于抗體的篩選，發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有分化為米色脂肪細(xì)胞的特點(diǎn)，認(rèn)為米色脂肪細(xì)胞可能起源于血管內(nèi)皮細(xì)胞。G.Barbatelli等［17］發(fā)現(xiàn)冷馴化使WAT中抗有絲分裂的C/EBPα基因表達(dá)增加，而與細(xì)胞繁殖有關(guān)的基因表達(dá)未改變，并結(jié)合脂肪組織的超顯微結(jié)構(gòu)認(rèn)為冷刺激可以誘導(dǎo)白色脂肪細(xì)胞直接分化轉(zhuǎn)化為米色脂肪細(xì)胞。而Tim則利用流式細(xì)胞儀分選出具有一定-特性的前體骨骼肌細(xì)胞（Sca-1+，CD45-，Mac1），并經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明這些細(xì)胞經(jīng)冷刺激或藥物誘導(dǎo)也可分化為米色脂肪細(xì)胞［7］。目前的研究證據(jù)主要指向這三種不同的轉(zhuǎn)變機(jī)制，但不能排除這三種機(jī)制共同作用，若有共同作用，何種作用為主導(dǎo)皆有待闡明。相信以BAT為靶點(diǎn)，安全有效的誘導(dǎo)WAT中具有功能性的米色脂肪細(xì)胞的方法必將成為防治肥胖等代謝疾病研究的新方向。

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The comparations of tree shrews（Tupaia belangeri）adipose tissue slices preliminary study under cold-acclimation

SUN Shu-ran1，ZHU Wan-long1，CHEN Jin-long2，CAO Neng1，GAO Wen-rong1，ZUO Mu-ling1，YE Fang-yan1，F(xiàn)U Jia-hao1，YANG Tao1，WANG Zheng-kun1
（1.Key Laboratory of Ecological Adaptive Evolution and Conservation on Animals-Plants in Southwest Mountain Ecosystem of University in Yunnan Province School of Life Science Yunnan Normal University Kunming 650500 China；2.Haikou Forest Farm of Kunming，Kunming 650114，China）

ObjectiveTo understand the fat cells morphological changes during different periods under cold acclimation in tree shrews，whether the cold acclimation can induce cream-colored fat cells in white adipose tissue（beige adipocytes），and provide morphological basis.MethodsThe Hematoxylin-Eosin staining sections，Immunohistochemical staining sections and Immunofluorescence staining sections are compared.ResultsWith the prolonged cold acclimation，the white fat cells and brown fat cells are decreased significantly，and the uncoupling protein1 expression in brown adipose tissues are increased.At the same time，abdominal subcutaneous white adipose tissue may have occurred browning，produce some shallow brown fat cells with UCP1 expression，namely the beige fat cells.ConclusionsDifferent staining sections not only can clearly observe the morphological changes of fat cells，but also observe UCP1 from antibody positive color expression changes，and provide basic materials for the study of the adipose tissues in tree shrews.

Cold acclimatization；Adipose tissues；Hematoxylin-Eosin staining sections；Immunohistochemical staining sections；Immunofluorescence staining sections

王政昆（1959-），男，教授，研究方向：動物生理生態(tài)，E-mail：wzk_930@126.com。

R-332

A

1671-7856（2015）11-0001-04

10.3969.j.issn.1671-7856.2015.11.001

國家科技支撐計劃項(xiàng)目子課題（2014BAI01B01-06）；國家國際科技合作專項(xiàng)（2014DFR31040）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31360096）。

孫舒然（1990-），女，漢族，碩士生，研究方向：動物生理生態(tài)，E-mail：18487198653@163.com。

﹞2015-10-12