習德娥 韓 莉 譚 超 楊曉東 (三峽大學第一臨床醫(yī)學院，宜昌4 430001)

核酸受體P2X7 在一些炎癥、骨和神經(jīng)細胞中表達，被組織損傷、炎癥和感染部位釋放的ATP 激活后引起許多細胞反應如鈣離子內(nèi)流、MAPK 活化、炎癥介質(zhì)釋放和凋亡，是炎癥和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一個有希望的治療靶點和潛在的生物標志物。許多研究把焦點集中于P2X7 受體在細胞死亡和介質(zhì)處理中的作用(例如炎癥小體裂解IL-1 前體)，但是P2X7 受體與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)系很少有報道。這篇綜述重點介紹P2X7 受體與基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)系。

1 P2X7 受體的結(jié)構(gòu)和功能

P2X7 受體由595 個氨基酸組成，包含一個短的胞內(nèi)N 端區(qū)域，2 次跨膜域，一個大的胞外配體結(jié)合域及一個對脂質(zhì)和相應的胞漿蛋白表達有重要作用的胞內(nèi)C 端結(jié)構(gòu)域。此受體有N-連接糖基化位點，殘基N187 位于兩個會減弱P2X7 受體功能的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)—E186K 和L191P 附近，其糖基化對細胞表面的受體表達和正常功能的發(fā)揮至關(guān)重要［1］。P2X7 受體還包括胞內(nèi)的棕櫚?；稽c，這些位點與細胞膜的耐去污劑特性有重要關(guān)系［2］。P2X7 受體與其他的P2X 家族成員不同，其C 端尾比其他的P2X 受體至少長100 個氨基酸，是P2X 受體中促進非特異性孔道形成的受體之一。P2X7 的持續(xù)性激活導致可逆的孔道(允許分子量＜900 Da 的小分子通過)的形成。在某些特定的環(huán)境中，孔道形成與凋亡的誘導有關(guān)。最近研究發(fā)現(xiàn)P2X7 受體受到配體的短暫刺激后，將導致基因轉(zhuǎn)錄的改變而不是細胞死亡［3，4］。

2 P2X7 受體與基因轉(zhuǎn)錄因子

P2X7 的配體能夠刺激一些轉(zhuǎn)錄因子的表達、活化和/或核易位，這些轉(zhuǎn)錄因子包括早期生長反應家族(Egr-1、Egr-2 和Egr-3)成員、活化的T 細胞核因子(NFAT)，核因子-κB(NF-κB)家族成員，循環(huán)AMP 反應成分(CRE)結(jié)合蛋白(CERB)和AP-1 家族成員c-Fos，F(xiàn)osB，JunB。

2.1 Egr 早期反應因子(The early growth responsive gene，Egr)為重要的核轉(zhuǎn)錄因子，激活后與靶基因啟動子上特異的結(jié)合位點作用而調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達，參與從細胞的生長增殖到分化以及凋亡等相關(guān)的多種基因的表達。鋅指轉(zhuǎn)錄因子Egr-1、Egr-2、Egr-3 是在炎癥中扮演重要角色的早期基因，在許多細胞中促有絲分裂信號能誘導其表達［5］。Egr-1 基因編碼一個80～82 kD 的鋅指轉(zhuǎn)錄蛋白，通過與特異的DNA 序列或者與轉(zhuǎn)錄復合物上的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物作用控制基因轉(zhuǎn)錄，參與細胞生長、增殖、分化和基質(zhì)修復以及B 細胞和T 細胞的活化［6-8］，但Egr-2 和Egr-3 被認為促進T 細胞的失能［9］。最近有報道稱P2X7 配體促進這些因子的表達［10］。Stefano 等［11］使用表達P2X7 的HEK293細胞證實BzATP 能通過活化ERK1/2 和轉(zhuǎn)錄因子Elk-1 促進Egr-1 轉(zhuǎn)錄的上調(diào)，支持P2X7 的活化影響基因的轉(zhuǎn)錄這一觀點。Friedle 等［10］發(fā)現(xiàn)BzATP 能夠誘導N9神經(jīng)膠質(zhì)細胞和初級神經(jīng)膠質(zhì)細胞中Egr-1、Egr-2、Egr-3 的表達。Egr RNAi 導入N9 神經(jīng)膠質(zhì)細胞后，BzATP 誘導的IL-6 的表達減少，LPS 和BzATP 共同誘導的TNF-a 的產(chǎn)生也減少。而且，有報道發(fā)現(xiàn)Egr-1 使VEGF 在肺癌細胞中的表達成為可能［12］，暗示我們觀察到的人單核細胞中的P2X7 依賴性的VEGF 表達可能通過Egr-1 的活化產(chǎn)生。

2.2 NFAT 活化T 細胞核因子(Nuclear factor of activated T cells，NFAT)家族(NFAT1-5)被廣泛地發(fā)現(xiàn)于各種免疫細胞和組織中，調(diào)控許多炎癥介質(zhì)的表達。NFAT 由胞漿中鈣離子的升高激活。細胞內(nèi)鈣離子的增加激活鈣調(diào)蛋白，從而激活絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶、鈣神經(jīng)素。鈣神經(jīng)素使NFAT 去磷酸化，暴露核輸入序列，允許轉(zhuǎn)錄因子易位入細胞核，促進基因轉(zhuǎn)錄［13］。一些研究小組已經(jīng)證明NFAT 由P2X7 受體調(diào)控，因此，核酸引起的此轉(zhuǎn)錄因子家族的活化可能是P2X7 受體調(diào)控免疫調(diào)節(jié)因子表達的一個重要機制。Yip 等［14］表明Jurkat T 細胞中的P2X7RNAi 減弱NFAT 的活化和由T 細胞活化因子誘導的IL-2 的轉(zhuǎn)錄。Adinolfi 等證明P2X 抑制劑(Ox-ATP)減少外源性表達P2X7 受體的HEK293 細胞上的NFAT1 的核表達。Kataoka 等［15］表明ATP激活MG-5 神經(jīng)膠質(zhì)細胞上NFAT1 的表達。Ferrari等［16］報道BzATP和ATP激活N9膠質(zhì)細胞的NFAT。

2.3 NF-κB 核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是一種具有基因轉(zhuǎn)錄多項調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，能與多種細胞基因啟動子或增強子序列特定位點發(fā)生特異性結(jié)合而促進轉(zhuǎn)錄和表達，與炎癥反應、免疫應答以及細胞的增生、轉(zhuǎn)化和凋亡等重要的病理生理過程密切相關(guān)。NF-κB 通過與抑制劑κB(IκB)的結(jié)合以未活化狀態(tài)存在于胞漿中［17］。IκB被IκB 激酶(IKK)磷酸化后，NF-κB 進入核中，促進基因轉(zhuǎn)錄。NF-κB 調(diào)控大量的免疫調(diào)節(jié)基因的誘導，包括IL-6、IL-8、TNF-a、iNOS 和COX-2［18，19］。已有報道發(fā)現(xiàn)P2X7 激動劑刺激NF-κB 的易位和DNA結(jié)合。Ferrari 等表明ATP 能刺激鼠膠質(zhì)細胞系N9和N13 上NF-κB 結(jié)合到DNA，抗氧處理能抑制這種結(jié)合。Budagian［20］等報道ATP 能刺激Jurkat T 細胞中NF-κB 與DNA 結(jié)合。Korcok［21］等證明BzATP 能誘導鼠破骨細胞中NF-κB 的核易位，但是P2X7 被敲除的小鼠的破骨細胞不能被誘導。BzATP 誘導鼠RAW 264.7 巨噬細胞和人外周血單個核細胞中NFκB 和DNA 結(jié)合［22］。

2.4 CREB cAMP 應答元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)作為細胞核內(nèi)調(diào)控因子，通過自身磷酸化實現(xiàn)調(diào)節(jié)功能，從而調(diào)控細胞周期［23，24］。亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子在控制許多細胞生理過程中起作用，包括糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)，細胞生存和炎癥介質(zhì)產(chǎn)生。絲氨酸133 上CREB 的磷酸化通過CREB 結(jié)合蛋白(CBP)或者p300 刺激共活化，允許CREB 與cAMP 反應性基因的啟動子上的保守的CREB 反應元素(CREs;5'-TGACGTCA-3')結(jié)合。在一些免疫調(diào)節(jié)基因如IL-2、IL-6、IL-10 和TNF-a 的啟動子里含有CREB 位點［25］。P2X7 的活化能夠引起單核細胞上CREB 激活，用P2X7 激動劑BzATP刺激細胞后會導致依賴于ERK1/2 和鈣離子的絲氨酸133 位的CREB 磷酸化［4］。P2X7 配體會導致人外周血單個核細胞、人單核細胞株THP1、鼠巨噬細胞株RAW264.7 和外源性表達P2X7 受體的HEK293 細胞上的CREB 活化。P2X7 功能缺失的RAW264.7 突變株、RAWS324F 細胞在BzATP 刺激后并不表現(xiàn)出CREB 磷酸化，但是LPS 或anisomycin(p38MAPK 的激動劑)刺激后會導致CREB 活化。Potucek［26］等報道BzATP 能夠激活BV-2 膠質(zhì)細胞的CREB。用CREB 陰性構(gòu)建體抑制CREB 的活化后，AP-1 基因c-Fos 和FosB 的表達明顯減弱，這進一步支持P2X7 在基因表達轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起作用［3，4］。

2.5 AP-1 AP-1(Activating protein 1)是一類由立即早期基因編碼的核轉(zhuǎn)錄因子，能被紫外光、生長因子和氧化應激等許多因素激活，調(diào)控對轉(zhuǎn)移、侵蝕、分化、缺氧、血管發(fā)生、增殖和凋亡有重要作用的基因的轉(zhuǎn)錄［27-29］。這個轉(zhuǎn)錄因子家族包括c-Jun、JunB、JunD、Fra-1、Fra-2、c-Fos、FosB、ΔfosB 以及與基因啟動子中AP-1 位點結(jié)合的由它們形成的二聚體［17，30］。AP-1 家族成員含有一個基本的亮氨酸拉鏈區(qū)，此區(qū)域?qū)υ摮蓡T與其他的AP-1 成員二聚化以及與DNA 結(jié)合有重要作用。具有轉(zhuǎn)錄活性的AP-1蛋白由一個Jun 蛋白和一個Fos 家族成員組成。正常條件下，AP-1 蛋白的濃度和活性極低，分子構(gòu)成以Jun 同源二聚體為主。細胞受到刺激時，AP-l 蛋白水平短暫而迅速地升高，并轉(zhuǎn)變?yōu)橐詂-Fos、c-Jun異源二聚體為主要存在形式，DNA 連接和誘導轉(zhuǎn)錄的能力也隨之迅速升高;以后隨著半衰期較短的c-Fos 的降解，AP-1 又恢復至基礎水平和惰性狀態(tài)。我們和其他研究組均發(fā)現(xiàn)P2X7 配體能夠誘導AP-1轉(zhuǎn)錄因子的表達和活化［3］。P2X7 配體能夠較弱地誘導c-Fos 和FosB 的表達，但是能強烈的促進巨噬細胞和成骨細胞中FosB 和ΔFosB 的產(chǎn)生［3］，這些激動劑刺激FosB 蛋白與DNA 的結(jié)合。FosB 和ΔFosB 是2 個研究最少的AP-1 家族成員，但是越來越多的研究支持它們在炎癥、骨更新和神經(jīng)功能中充當轉(zhuǎn)錄因子的角色。

3 ATP/P2X7/FosB 路徑

FosB 和ΔFosB 由一個PEST 區(qū)(富含脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸的序列)、一個基本區(qū)和一個亮氨酸拉鏈組成。亮氨酸拉鏈是FosB 和Jun 相互作用的主要位點［31］。ΔFosB 是FosB 被截短后的接合突變體，是全長的FosB 的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域中的一部分，與FosB 相比，其C 端缺少101 個氨基酸。ΔFosB 被假設為藥物成癮發(fā)展過程中的一個“分子閘門”，對正常精神行為的維持至關(guān)重要。FosB 和ΔFosB 還具有許多功能，包括調(diào)控炎癥反應和骨形成的能力。

ATP/P2X7/FosB 路徑以前未被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在我們發(fā)現(xiàn)其存在于單核細胞和成骨細胞中，參與多個免疫調(diào)控因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。P2X7 配體(BzATP、ATP)瞬間刺激后會誘導外周血單核細胞、RAW264.7 巨噬細胞、鼠骨髓衍生的巨噬細胞、前成骨細胞系MC3T3-E1 和穩(wěn)定表達P2X7 的HEK293 細胞中FosB 和ΔFosB 的表達［3］。為了進一步證實P2X7介導FosB 和ΔFosB 的產(chǎn)生，使用最近研發(fā)的P2X7抑制劑進行對照試驗，發(fā)現(xiàn)P2X7 S342F 突變(會導致P2X7 功能缺失)的RAW 264.7 細胞上BzATP 介導的FosB 和ΔFosB 的產(chǎn)生明顯減少。BzATP 不能誘導P2X7 缺陷的細胞株的FosB 與DNA 結(jié)合。P2X7 拮抗劑A438079 使RAW 264.7 巨噬細胞上BzATP 誘導的FosB 和ΔFosB 的產(chǎn)生減弱。這些說明P2X7 在核酸刺激后引起FosB 和ΔFosB 的表達。引人注意的是，低水平的BzATP(5～30 μmol/L)不能激活P2X7 介導的大多數(shù)細胞通路，例如離子通道活化和孔道形成，但是能夠誘導FosB 和ΔFosB 的表達［3］，表明FosB 和ΔFosB 是反映P2X7 活動最敏感的兩個介質(zhì)。BzATP 處理細胞1 h 后FosB 和ΔFosB 均表達，F(xiàn)osB 持續(xù)至少3 h，但是BzATP 處理RAW264.7 細胞8 h 后FosB 和ΔFosB 大幅度降解，這與大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(PC12)中在用20%血清處理后8 h 內(nèi)FosB 和ΔFosB 降解這一結(jié)果一致［32］。

4 結(jié)語

核酸受體P2X7 是炎癥反應的一個重要調(diào)節(jié)物，大量的研究支持P2X7 是炎癥時的一個有意義的治療靶點，P2X7 拮抗劑的研發(fā)將給臨床上炎癥性疾病如類風濕性關(guān)節(jié)炎的治療帶來希望。最近大量報道支持P2X7 誘導免疫調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，為P2X7控制多個生理病理反應的機制提供新觀點。P2X7的生物學研究領域正在迅速地擴大，此受體與免疫調(diào)控、骨形成和神經(jīng)功能有關(guān)的許多機制還有待研究。

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