張宏偉，彭心宇，吳向未，楊宏強，呂海龍，張示杰

3種不同劑量的青蒿琥酯抗小鼠細粒棘球蚴疾病作用的比較

張宏偉，彭心宇，吳向未，楊宏強，呂海龍，張示杰

目的 探討高、中、低3種不同劑量青蒿琥酯體內(nèi)抗包蟲的作用。方法 建立小鼠腹腔細粒棘球蚴疾病模型，隨機分為4組，每天分別給與高(200 mg/kg)、中(100 mg/kg)、低(50 mg/kg)3種劑量的青蒿琥酯注射液以及生理鹽水，腹腔注射治療3月后，觀察小鼠體內(nèi)包蟲囊腫的外觀發(fā)育情況、囊濕重、包蟲囊壁的病理改變、電鏡下超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果 中劑量組小鼠總囊重明顯少于其他各組。中等劑量組抑囊率高于其他各組。病理及電鏡發(fā)現(xiàn)3種劑量下包蟲囊壁均有不同程度的破壞，其中中等劑量組囊腫中到重度破壞，角皮層紋理模糊，生發(fā)層細胞減少，甚至斷裂，細胞核及線粒體溶解或退變。結(jié)論 在相同的飼養(yǎng)條件下，中等劑量的青蒿琥酯注射液治療小鼠腹腔細粒棘球蚴疾病的效果最佳。

細粒棘球蚴;青蒿琥酯;劑量;治療作用

細粒棘球蚴病是威脅人類健康的全球性的寄生蟲病，目前的治療方法以手術(shù)治療為主，藥物治療為輔。對于失去手術(shù)指征的患者，藥物治療是唯一的選擇，因此關(guān)于藥物治療包蟲病的研究一直備受關(guān)注?？汞懠驳囊痪€藥物青蒿琥酯，作為免疫調(diào)節(jié)劑，在防治寄生蟲方面的研究逐漸成為熱點，但其用量與免疫效果之間關(guān)系仍存在爭議。本研究通過建立小鼠腹腔細粒棘球蚴模型，取高、中、低3種劑量的青蒿琥酯注射液治療3月，觀察其抗包蟲治療效果，從而尋求最佳治療劑量。

1 材料與方法

1.1 實驗動物以及藥品準備 雌性昆明小鼠60只，體重(20±5) g，由石河子大學實驗動物研究中心提供。青蒿琥酯注射液桂林南藥股份有限公司提供，生產(chǎn)批號ZA080103，使用時溶解于5%碳酸氫鈉溶液，并用生理鹽水稀釋到所需的濃度。

1.2 動物模型的建立 從自然感染的綿羊肝細粒棘球蚴囊中無菌抽取囊液，自然沉淀后去上清，收集原頭節(jié)，反復用生理鹽水沖洗，1 000 r/min離心數(shù)次，去上清液，伊紅染色，鏡下活檢計算其活性率為80%以上 ，將原頭節(jié)稀釋到1 500個/mL，加入使每毫升均含青霉素和鏈霉素各500 U，每只小鼠注射1 mL稀釋液約1 500個原頭節(jié)。采取多點注射，保證接種均一性。

1.3 給藥方法 將包蟲模型小鼠隨機分為4組，高劑量組、中劑量組、低劑量組和模型對照組，每組15只，每天分別腹腔注射1次青蒿琥酯注射液200 mg/kg，100 mg/kg，50 mg/kg和等劑量的生理鹽水，接種后第2 d開始，連續(xù)治療3個月，解剖測量。

1.4 療效評價

1.4.1 體外直接殺滅作用觀察 取20%的鹽水作對照，選取10 min，20 min，30 min時間點，5%伊紅染色，光鏡下觀察青蒿琥酯注射液的混勻處理的原頭節(jié)的存活情況，判斷是否能用于術(shù)中滅活原頭節(jié)。

1.4.2 細粒棘球蚴囊的大體觀察 肉眼觀察細粒棘球蚴囊發(fā)育的外觀形態(tài)。

1.4.3 細粒棘球蚴囊濕重 停藥后第2 d，摘取腹腔全部囊稱重，計算抑制率。

抑制率=(C-T)/C×100%(C：對照組囊濕重均值；T：治療組囊濕重均值)

1.4.4 病理組織學觀察 取細粒棘球蚴囊腫，用10%的中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，HE染色、切片，按照細粒棘球蚴囊生發(fā)層病理損傷程度分為3級，一級(正常)：生發(fā)層細胞核及胞質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰完整，角質(zhì)層紋理清晰；二級(變性)：生發(fā)層或角質(zhì)層空泡樣或顆粒樣變性，基質(zhì)溶解；三級(壞死)生發(fā)層細胞核固縮、溶解、消失，角質(zhì)層崩解或嗜酸性壞死。

1.4.5 透射電鏡觀察 部分棘球蚴囊置4%戊二醛前固定，四氧化鋨后固定，丙酮梯度脫水，EPDN.812包埋，超薄切片，置銅網(wǎng)上經(jīng)醋酸鈾、檸檬酸鋁雙重染色后，透射電鏡觀察。

1.5 統(tǒng)計學分析 運用SPSS13.0對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 體外直接殺滅頭節(jié)效果 青蒿琥酯注射液處理頭節(jié)，10～30 min內(nèi)觀察，在原頭蚴周圍出現(xiàn)環(huán)形隔離帶，將原頭節(jié)與外界溶液隔離，頭節(jié)染色效果不明顯，內(nèi)部結(jié)構(gòu)可見，頭節(jié)存活(圖1)。20%濃鹽水在10 min時，0.5%伊紅染色，高倍鏡下觀察原頭節(jié)完全紅染，糖原顆粒消失，內(nèi)部結(jié)構(gòu)無法辨認，頭節(jié)死亡(圖2)。

Endo-staining is not satisfactory; inner structure can be identified; the protoscoleces are alive(200×).

圖1 青蒿琥酯處理頭節(jié)30 min鏡下觀察

Fig.1 Changes of protoscoleces mixed with Art for 30 min, space to isolate the protoscoleces can be observed

Inner structure can not be identified; the protoscoleces are dead.(200×)

圖2 20%濃鹽水處理頭節(jié)10 min觀察

Fig.2 Changes of protoscoleces mixed with 20% saline for 10 min, the protoscoleces are fully stained

2.2 外觀形態(tài)肉眼觀察 各實驗組囊腫主要分布在胃小彎、肝表面以及游離于腹腔，其中對照組以及高劑量組囊腫體積較大，表面光滑透明，張力較高；中劑量組囊腫體積較小，表面渾濁，張力較??；低劑量組囊腫透亮度差，張力較高。

2.3 各組囊濕重 高(200 mg/kg)、中(100 mg/kg)、低(50 mg/kg)3種劑量的青蒿琥酯注射液以及生理鹽水，腹腔注射治療3月后，電子天平計算囊濕重分別為：(0.038 8±0.004 59)g，(0.014 1±0.003 24)g，(0.021 5±0.004 87)g, (0.044 4±0.006 27)g。抑囊率分別為：12.6%，68.2%，51.5%(表1)。

表1 3種劑量青蒿琥酯治療3月后，小鼠體內(nèi)棘球蚴囊腫濕重及抑囊率

Tab.1 Comparison of hydatid cyst wet weight and inhibition rate between control and treated groups in mice

Note: Compared with control,P<0.01,F=11.2.

2.3 組織學觀察 取大體組織，制作HE染色，病理切片，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：模型對照組囊腫角皮層呈多層紋理狀，生發(fā)層單層細胞結(jié)構(gòu)完整清晰。中等劑量組囊腫，角皮層模糊，生發(fā)層細胞數(shù)目明顯減少，結(jié)構(gòu)模糊，中-重度破壞(圖3)。低劑量組和高劑量組囊腫輕-中度破壞(表2)。

Cells’ number of the germinal layer was significantly decreased.(200×)

圖3 中劑量組治療3月后

Fig.3 After treatment with Art for 3 months, the corneous layer of the cysts is vagued

表2 小鼠細粒棘球蚴囊腫病理改變比較

Tab.2 Comparison of pathologic changes of hydatid cyst in mice

Note: Group comparison,χ2=28.570,P<0.01.

2.4 細粒棘球蚴囊腫超微結(jié)構(gòu)的觀察 與模型對照組相比，中等劑量組組織結(jié)構(gòu)破壞最為嚴重，表現(xiàn)為纖維囊壁內(nèi)組織炎性細胞、嗜酸性細胞浸潤，細胞分裂增殖，生發(fā)層細胞核模糊，甚至消失，線粒體退變，微毛蛻變(圖4)。低劑量與高劑量組，組織結(jié)構(gòu)均有不同程度的破壞。

Nucleus of the corneous layer disappeared and organelle damaged (6 000×).

圖4 中等劑量組治療3月后

Fig.4 After treatment with Art for 3 months

3 討 論

青蒿琥酯(Artesunate,Art)是半倍萜內(nèi)酯化合物青蒿素的衍生物 ,化學名為二青青蒿素-1 ,2-琥珀酸單酯,分子式為 C19O8H28,分子量384.43。2006年青蒿琥酯類藥物被世界衛(wèi)生組織定為瘧疾重癥搶救的首選藥物,它除了有效抗瘧疾作用外，尚有抗其他寄生蟲如血吸蟲[1]、肺孢子蟲[2]、弓形蟲[3]、棘球蚴[4-5]的作用，以及抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用。在治療棘球蚴方面，蒲秀英等[4]研究發(fā)現(xiàn)給與小鼠每天50 mg/kg劑量的青蒿琥酯治療腹腔繼發(fā)性棘球蚴病的效果優(yōu)于每天25 mg/kg劑量的效果，而有其他研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯作為免疫調(diào)節(jié)劑，較大劑量(小鼠每天200 mg/kg)有免疫抑制作用，小劑量(小鼠每天100 mg/kg)有免疫增強作用[6]。本實驗設(shè)計高、中、低3種劑量治療小鼠繼發(fā)性細粒棘球蚴疾病，觀察青蒿琥酯抗包蟲效果，尋求最佳治療劑量。

為證實青蒿琥酯能否用于術(shù)中滅活頭節(jié)，本研究另外設(shè)計了滅活實驗。體外滅活實驗研究發(fā)現(xiàn)，在原頭蚴的周圍出現(xiàn)明顯的隔離帶，可能的原因是青蒿琥酯微溶于水，易溶于碳酸氫鈉溶液，故將帶有青蒿琥酯的原頭蚴進行伊紅染色時，水溶液被排斥而形成隔離帶，原頭蚴著色不明顯，在30 min內(nèi)不能將其快速殺死，因此，不能用于術(shù)中滅活頭節(jié)。但是Martin Spicher[5]體外培養(yǎng)，觀察青蒿琥酯的抑制頭節(jié)作用發(fā)現(xiàn)，在40 μmol/L第6 d的時表現(xiàn)出強烈的抑制作用。

體內(nèi)實驗研究發(fā)現(xiàn)，中劑量組治療下抑囊率為68.2%，明顯高于高(12.6%)、低劑量組(51.5%)，并且病理切片以及電鏡研究表明，中等劑量組囊腫破壞最嚴重，表現(xiàn)在生發(fā)層細胞數(shù)目減少，細胞核模糊甚至消失，說明青蒿琥酯具有良好的抗棘球蚴的作用，與蒲秀英和Martin Spicher的研究一致，但所使用劑量不同。青蒿琥酯抗其他寄生蟲作用主要表現(xiàn)在破壞其膜系統(tǒng)，如蟲體的細胞膜、線粒體以及核膜[6-7]，并且在細胞免疫和體液免疫均發(fā)揮了重要的作用。作為免疫調(diào)節(jié)劑，在合適的劑量下，青蒿琥酯可提高小鼠機體免疫功能，可抑制棘球蚴引起的超敏反應(yīng)，病理切片觀察，青蒿琥酯治療后的包蟲囊腫生發(fā)層細胞數(shù)目明顯減少，結(jié)構(gòu)模糊，而中等劑量組的囊腫破壞最為嚴重。本實驗電鏡觀察包蟲囊腫生發(fā)層細胞發(fā)生核溶解，線粒體退變，據(jù)此可推斷青蒿琥酯抗包蟲病作用的機制可能為破壞其膜系統(tǒng)，減少其能量供給，阻止細胞核內(nèi)DNA的復制和逆轉(zhuǎn)錄，從而抑制包蟲的生長和繁殖。青蒿琥酯的免疫調(diào)節(jié)作用，與劑量有很大關(guān)系[8-9]，青蒿琥酯的作用機制目前研究發(fā)現(xiàn)可能與 Art阻止外鈣內(nèi)流有關(guān)通過影響細胞信號轉(zhuǎn)導，從而影響生發(fā)層細胞攝取營養(yǎng)的作用，從而抑制包蟲囊腫的生長[10]。除此之外，青蒿琥酯具有抗纖維化的作用[11]，包蟲囊腫的外囊的形成是棘球蚴在不斷的膨脹生長過程中，包繞在周圍的肉芽腫性組織不斷纖維化的結(jié)果，最終形成排列紊亂、致密的纖維組織[12]。在包蟲囊腫的形成過程中伴有纖維化的發(fā)生，而青蒿琥酯能夠抑制纖維化，因此包蟲不能形成完整的囊壁，未能對棘球蚴形成良好的保護，在機體的免疫攻擊下，從而使包蟲生長受到抑制。本實驗研究發(fā)現(xiàn)中等劑量組的治療明顯好于高劑量組和低劑量組，對于小鼠來說，用中等劑量治療，能夠更好的提高機體免疫力，發(fā)揮更好的免疫促進作用和抗包蟲作用。

[1]Zhang YP, Huang YX, Sun MY, et al. An introduction on artesunate-a new type schistosmiasis prophylactic[J]. J Pract Parasitic Dis, 2002, 10(1):44-45. DOI:10.3969/j.issn.1672-2116.2002.01.021 (in Chinese) 張燕萍, 黃軼新, 孫明玉,等. 血吸蟲病新型預(yù)防藥青蒿琥酯[J].實用寄生蟲病雜志, 2002, 10(1):44-45. DOI:10.3969/j.issn.1672-2116.2002.01.021

[2]Ye B, Chen YT, Liu CW. The effects of three artemisinin derivates on genes ofPneumocystiscarinii[J]. Chin J Zoonoses, 2002, 18(1):26-29. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2002.01.007 (in Chinese) 葉彬, 陳雅棠, 劉成偉. 青蒿素衍生物對卡氏肺孢子蟲基因的影響[J]. 中國人獸共患病學報, 2002, 18(1):26-29. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2002.01.007

[3]Sarciron ME, Saccharin C, Petavy A. Effects of artesunate, dihydroartemisinin, and ailartesunate-dihydroartemisinin combination againstToxoplasmagondii[J]. Am J Trop Med Hyg, 2000, 62(1):73-76.

[4]Pu XY, Fu XY, Wang Q. Observation on the efficacy of artesunate against murine echinococcosis[J]. Chin J Parasitic Dis, 2005, 18(05):336-338. DOI:10.3969/j.issn.1673-5234.2005.05.005 (in Chinese) 蒲秀英，傅宣英，王琪. 青蒿琥酯治療小鼠繼發(fā)性棘球蚴病的效果觀察[J]. 中國寄生蟲病防治雜志, 2005, 18(05):336-338. DOI:10.3969/j.issn.1673-5234.2005.05.005

[5]Spicher M, Roethlisberger C, Lany C, et al.Invitroandinvivotreatments of echinococcus protoscoleces and metacestodes with artemisinin and artemisinin derivatives[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2008, 52(9):3447-3450. DOI:10.1128/AAC.00553-08

[6]Wang CE, Xu ZT, Cao JT, et al. Ultrastructure study of effects of artesunate onToxoplasmain Hela cell[J]. J Chin Electr Microscopy Soc, 2002, 21(5):515-516. DOI:10.3969/j.issn.1000-6281.2002.05.025 (in Chinese) 王翠娥，徐在海，曹軍田, 等. 青蒿琥酯對弓形蟲滋養(yǎng)體超微結(jié)構(gòu)的影響[J]. 電子顯微學報, 2002, 21(05):515-516. DOI:10.3969/j.issn.1000-6281.2002.05.025

[7]Ni XY, Chen YT, Wang J, et al. Study on the anti-Pneunocystiscariniieffect of arteminsin derivativesinvitrowith transmission electron microscopic[J]. J Chin Antibiotics, 2002, 27(11):691-694. DOI:10.3969/j.issn.1001-8689.2002.11.015 (in Chinese) 倪小毅，陳雅棠，王健, 等. 青蒿素衍生物體外抗卡氏肺孢子蟲不同時相透射電鏡觀察[J]. 中國抗生素雜志, 2002, 27(11):691-694. DOI:10.3969/j.issn.1001-8689.2002.11.015

[8]Chen H, Maibach HI. Topical application of artesunate on guinea pigallergic contact dermatitis[J]. Contact Dermatitis, 1994, 30(5):280-282.

[9]Zhang RZ, Gao YX. Effects of artesunate on the function of phagocytes in mice[J]. Chin J Dermatovenereol, 1999, 13(4):205-206. (in Chinese) 張汝之, 高玉祥. 青蒿琥酯對小鼠吞噬細胞功能的影響[J]. 中國皮膚病雜志, 1999, 13(4):205-206.

[10]Luo L, Diane M, Loilliam BG. Blockade of Calcium-dependent chloride current in Xenopus Oocytes by chloride channel blockers and antimalarial drugs[J]. Cell Physiol Biochem, 1991, 1(5-6):251-254.

[11]Yang YF. Pharmacological action and clinical application of artemisinin and the derivatives[J]. Chin J Clin Pharmacol, 2003, 12(4):253-254. (in Chinese) 楊耀芳. 青蒿素及衍生物的藥理作用和臨床應(yīng)用[J]. 中國臨床藥學雜志, 2003, 12(4):253-254

[12]Wu XW, Peng XY, Zhang SJ, et al. Formation mechanisms of the fibrous capsule around hepatic and splenic hydatid cyst[J]. Chin J Parasitol Parasit Dis, 2004, 22(01):1-4. DOI:10.3969/j.issn.1000-7423.2004.01.001 (in Chinese) 吳向未, 彭心宇, 張示杰, 等. 肝脾棘球蚴囊周圍纖維性囊壁形成機制的差異及臨床意義[J]. 中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志, 2004, 22(1):1-4. DOI:10.3969/j.issn.1000-7423.2004.01.001

Effects of three dosage of artesunate on anti-echinococcosis in mice

ZHANG Hong-wei,PENG Xin-yu,WU Xiang-wei,YANG Hong-qiang,LYU Hai-long,ZHANG Shi-jie

(TheFirstAffiliatedHospital,SchoolofMedicine,ShiheziUniversity,Shihezi832002,China)

To explore the therapeutic effects of high, medium and low dosage of artesunate on anti-echinococcosis of mouse, abdominal mouse model were separated into 4 treatment groups of 10 animals each. Drug suspensions were prepared in 0.5% carboxymethylcellulose (CMC) and applied as follows: 200 mg/kg/d, 100 mg/kg/d, 50 mg/kg/d and 0.9% Sodium Chloride (control group). Treatment began at the next day of inoculation. Three months later, mice were sacrificed and parasite tissue removed from the peritoneal cavity, and the parasite appearance, weight, pathologic and ultra structure changes was determined. Parasite weight was as follows: within the control--(0.044 4±0.006 27 g); 200 mg/kg/d group--(0.038 8±0.004 59 g); 100 mg/kg/d group--(0.014 1±0.003 24 g); 50 mg/kg/d group--(0.021 5±0.004 87 g). The inhibition ratio was 12.6%, 68.2%, and 51.5% respectively. All groups had pathologic and ultra structure changes. Of the total, mice in the medium dosage groups were severely damaged, which manifested as corneous layer vagued. Amount of cells in germinal layer decreased significantly. The nucleus vagued and even disappeared and mitochondria showed cataplasis, which suggested that the treatment with 100 mg/kg/d has the best effect on mouse echinococcosis.

echinococcosis; artesunate; different dosage; therapeutic effect

Zhang Shi-jie, Email: zsj-sh@tom.com

國家自然科學基金資助項目(No.81160199 )

張示杰，Email:zsj-sh@tom.com

石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，石河子 832002

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.01.009

R383.3

A

1002-2694(2015)01-0041-04

2014-04-24；

2014-10-18

Funded by the National Natural Science Foundation of China (No. 81160199)