劉 英，王 月，馬 青，李世軍，黃 艷，周敬祝，余 春，田克誠(chéng)，唐光鵬，王定明

貴州省2013年人間布魯氏菌病病原體種/型鑒定與分析

劉 英，王 月，馬 青，李世軍，黃 艷，周敬祝，余 春，田克誠(chéng)，唐光鵬，王定明

目的 對(duì)2013年貴州省人間布魯氏菌病疑似病例進(jìn)行病原學(xué)診斷與分析，為病例的確診和疫情控制提供病原學(xué)依據(jù)。方法 采用傳統(tǒng)方法和分子生物學(xué)方法對(duì)從布魯氏菌病疑似患者血液分離的可疑布魯氏菌進(jìn)行鑒定和分析。結(jié)果 從疑似患者血液分離出可疑菌株13株，傳統(tǒng)方法將其中的11株經(jīng)鑒定為羊種生物3型布魯氏菌，其余2株未能定種/型。布魯氏菌屬特異性PCR(BCSP31-PCR)將13株菌株鑒定為布魯氏菌屬細(xì)菌，種/型特異性PCR(AMOS-PCR)將其中的11株鑒定為羊種布魯氏菌，其余2株未能定種/型。結(jié)論 2013年貴州省人間布魯氏菌病病例共分離出13株布魯氏菌，羊種生物3型布魯氏菌為貴州省2013年人間布魯氏菌病病原體的主要流行菌種/型，占84.6%(11/13)，該研究結(jié)果為布病病例的確診和疫情的控制提供了病原學(xué)依據(jù)。

布魯氏菌病；病原學(xué)診斷；PCR；貴州

布魯氏菌病(Brucellosis)(以下簡(jiǎn)稱布病)是由布魯氏菌屬(Brucella)的細(xì)菌侵入機(jī)體引起世界性、多宿主感染的人獸共患病[1]。貴州省于2010年首次從貴州省山羊血液分離到羊種布魯氏菌,證實(shí)了畜間布病的存在[2],2012年從1例患者全血中分離到羊種布魯氏菌，證實(shí)了貴州省人間布魯氏菌病疫情的存在[3]。隨后布病疫情在我省迅速擴(kuò)散，散發(fā)和爆發(fā)疫情時(shí)有發(fā)生，直至2012年疫情已覆蓋我省貴陽(yáng)、黔南、黔東南、銅仁、遵義、黔西南和六盤水7個(gè)州(市)，防控形勢(shì)非常嚴(yán)峻。本研究采用傳統(tǒng)和分子生物學(xué)方法對(duì)貴州省2013年從患者血液分離的13株布魯氏菌可疑菌株進(jìn)行鑒定和分析，為病例的確診和疫情控制提供病原學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 實(shí)驗(yàn)菌株為從貴州省2013年27例布病抗體陽(yáng)性的疑似布病患者血液標(biāo)本分離的布魯氏菌可疑菌株13株(命名為GZ13MCB、GZ13WYL、GZ13WYT、GZ13HJW、GZ13DGY、GZ13ZXY、GZ13LDZ、GZ13LXC、GZ13ZC、GZ13ZFH、GZ13YTX、GZ13CB、GZ13ZSX)，其中遵義市8株，貴陽(yáng)市2株，務(wù)川縣2株，銅仁地區(qū)1株。陽(yáng)性對(duì)照菌株為布魯氏菌疫苗株A19(牛種)、M5(羊種)和S2(豬種)(購(gòu)自蘭州生物制品研究所)

1.2 主要試劑 布魯氏菌培養(yǎng)基采用進(jìn)口布魯氏菌肉湯(BD公司，貨號(hào)為211088)和布魯氏菌瓊脂(BD公司，貨號(hào)為211086)成品培養(yǎng)基按照說(shuō)明書(shū)配制成雙相培養(yǎng)基(培養(yǎng)瓶)。凍干布魯氏菌陽(yáng)性血清、凍干布魯氏菌單項(xiàng)特異性血清(A、M、R)和布魯氏菌特異噬菌體(Tb和Wb)均由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所提供。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。TaKaRa PCR相關(guān)試劑購(gòu)買于大連寶生物公司。

1.3 傳統(tǒng)方法鑒定 革蘭氏染色、單因子血清凝集實(shí)驗(yàn)、噬菌體裂解實(shí)驗(yàn)等傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)按照《布魯氏菌防治手冊(cè)》提供的方法進(jìn)行[ 4]。

1.4 DNA提取 挑取布魯氏菌可疑菌落接種于布魯氏菌瓊脂平板培養(yǎng)48 h后采用水煮法提取細(xì)菌核酸。

1.5 BCSP31-PCR法鑒定布魯氏菌屬 采用布魯氏菌屬特異性基因BCSP31作為定屬基因，按照參考文獻(xiàn)[5]提供的B4和B5引物序列和參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，B4和B5引物序列見(jiàn)表1。

1.6 AMOS-PCR 法鑒定布魯氏菌種/型 采用參考文獻(xiàn)[6]提供的以布魯氏菌屬IS711插入序列為基礎(chǔ)建立的AMOS-PCR引物及參數(shù)進(jìn)行布魯氏菌種/型的鑒定(見(jiàn)表1)。

2 結(jié) 果

2.1 菌落觀察 將疑似菌株轉(zhuǎn)接布魯氏菌瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，菌落大小約0.5 mm、圓形、邊緣整齊、無(wú)色半透明、呈露滴狀、折光明亮，表面光滑濕潤(rùn)、稍隆起、均質(zhì)樣，符合布魯氏菌的菌落形態(tài)特征。

2.2 染色鑒定 對(duì)轉(zhuǎn)接菌株培養(yǎng)后的菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，結(jié)果為革蘭陰性、紅色、短小桿菌，多為單個(gè)，有少數(shù)雙或鏈狀排列。

2.3 常規(guī)方法鑒定布魯氏菌種/型 布魯氏菌單相特異性血清A、M和R與可疑菌落凝集試驗(yàn)及噬菌體裂解實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本研究中的13株布魯氏菌疑似菌株中的11株菌株為羊種生物3型，而其余2株不能確定鑒定結(jié)果(表2)。

2.4 BCSP31-PCR鑒定 煮沸法提取菌株核酸，經(jīng)BCSP31-PCR擴(kuò)增后，采用1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果顯示本研究中的13株分離菌株及陽(yáng)性對(duì)照均出現(xiàn)分子量大小為223 bp的特異條帶，而陰性對(duì)照無(wú)條帶出現(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.5 AMSO-PCR檢測(cè)結(jié)果 AMOS-PCR對(duì)分離菌株和陽(yáng)性株菌核酸進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，本次分離菌株中的11株出現(xiàn)分子量大小為731 bp的特異條帶，陽(yáng)性對(duì)照菌株均出現(xiàn)預(yù)期特異條帶，而陰性對(duì)照及2株(GZ13CB和GZ13ZSX)分離株無(wú)條帶出現(xiàn)(見(jiàn)圖2)。

3 討 論

傳統(tǒng)的分類方法將布魯氏菌分為羊、牛、豬、犬、綿羊附睪和沙林鼠6個(gè)生物種共19個(gè)型，即牛種布魯氏菌B.abortus8個(gè)型；豬種布魯氏菌B.suis5個(gè)型；羊種布魯氏菌B.melitensis3個(gè)型；犬種布魯氏菌B.canis、綿羊附睪種布魯氏菌B.ovis和沙林鼠種布氏菌B.neotomae各1型。因其生物種、型和菌株的不同，致病力各異，對(duì)人致病力最強(qiáng)的為羊種菌，其次為豬種菌，牛種菌對(duì)人致病力弱。

M: Marker; 1-13: Strains GZ13MCB, Z13WYL, GZ13WYT, GZ13HJW, GZ13DGY, GZ13ZXY, GZ13LDZ, GZ13LXC, GZ13ZC, GZ13ZFH, GZ13YTX, GZ13CB and GZ13ZSX;14: A19; 15: M5; 16: S2; 17: Negative control.

圖1 布魯氏菌可疑菌株 BCSP31-PCR結(jié)果

Fig.1 Identification results ofBrucellasuspicious strains using BCSP3l-PCR

M: Marker; 1-13: Strains GZ13MCB, Z13WYL, GZ13WYT, GZ13HJW, GZ13DGY, GZ13ZXY, GZ13LDZ, GZ13LXC, GZ13ZC, GZ13ZFH, GZ13YTX, GZ13CB and GZ13ZSX;14: A19; 15: M5; 16: S2; 17: Negative control.

圖2 布魯氏菌可疑菌株AMOS-PCR鑒定結(jié)果

Fig.2 Identification results ofBrucellasuspicious strains using AMOS-PCR

據(jù)資料顯示[7]，既往鮮有病例的我國(guó)南方布病疫情日趨嚴(yán)重，不僅有與北方相同的羊種布魯氏菌引起的病例，還有因牛種布魯氏菌、豬種布魯氏菌引起不同體征的感染者，使布病疫情復(fù)雜化。貴州省地處我國(guó)西南片區(qū)，布病為貴州省近年新發(fā)傳染病，盡管既往監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示貴州省分離布魯氏菌均為羊種生物3型布魯氏菌[2-3]，但及時(shí)了解布病疫情的病原體及其種型分布對(duì)病例的確診和疫情的控制至關(guān)重要。

本研究中我們對(duì)2013年貴州省患者血液分離的13株布魯氏菌可疑菌株進(jìn)行鑒定和分析，結(jié)果顯示其中的11株可疑細(xì)菌為羊種生物3型布魯氏菌。然而，傳統(tǒng)分型方法雖然是目前布氏菌分型的金標(biāo)準(zhǔn)，但是受到干擾因素較多，對(duì)非典型菌株鑒定分類時(shí)，出現(xiàn)了難以鑒定的問(wèn)題[7]。本研究中2株菌(GZ13CB和GZ13ZSX)經(jīng)傳統(tǒng)的噬菌體裂解實(shí)驗(yàn)和單因子血清凝集試驗(yàn)未能定種/型可能與菌株的特殊性而不能采用傳統(tǒng)方法鑒定出種/型有關(guān)。

BCSP31-PCR是以布魯氏菌屬特異基因BCSP31為靶基因的檢測(cè)技術(shù)，李蘭玉等[5]曾專門對(duì)基于該基因設(shè)計(jì)的引物B4和B5進(jìn)行了研究，結(jié)果對(duì)6個(gè)種的布魯氏菌DNA都有特異的擴(kuò)增條帶[8-9]，因此，本實(shí)驗(yàn)中選 BCSP31- PCR做為布魯氏菌定屬檢測(cè)方法，結(jié)果分離自布魯氏病疑似病人血液的菌株經(jīng)BCSP31基因檢測(cè)證明全部為布魯氏菌屬細(xì)菌。AMOS-PCR根據(jù)條帶情況可鑒別布魯氏菌牛、羊 、豬種和綿羊附睪種。該方法在國(guó)內(nèi)外的布魯氏菌種型鑒定中得到了廣泛應(yīng)用[10-13]，國(guó)內(nèi)學(xué)者姜海等[6]采用AMOS-PCR鑒定不同種型的研究結(jié)果顯示，AMOS-PCR鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)方法符合率非常高。為了更準(zhǔn)確的種/型鑒定，本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)鑒定方法檢測(cè)的基礎(chǔ)上采用AMOS-PCR對(duì)可疑菌株進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，結(jié)果顯示可疑菌株中檢出11株羊種布魯氏菌，與傳統(tǒng)方法檢測(cè)結(jié)果一致。然而，AMOS-PCR在檢出范圍上只能鑒別布魯氏菌牛種1、2、4型(498 bp)、羊種布魯氏菌(731 bp)、豬種l型(285 bp)、綿羊附睪種(96l bp)[6]，而其余型別的牛種布魯氏菌(3、5、6、7、和9型)和豬種布魯氏菌(2、3、4、5型)、犬種及沙林鼠種布魯氏菌等均不在AMOS-PCR的檢測(cè)范圍以內(nèi)，本研究中的2株菌株(GZ13CB和GZ13ZSX)采用該技術(shù)檢測(cè)為陰性可能與AMOS-PCR技術(shù)本身的檢測(cè)范圍有關(guān)。

貴州省2010和2011分別從病原學(xué)角度證實(shí)了布病在畜間和人間布病的存在后[2-3]，布病疫情在貴州省迅速擴(kuò)散，防控形勢(shì)非常嚴(yán)峻。本研究結(jié)果顯示，貴州省2013年人間布魯氏菌病患者分離菌株中的羊種生物3型布魯氏菌占84.6%(11/13)，提示羊種生物3型布魯氏菌為貴州省2013年間主要流行種/型，羊?yàn)橘F州省人間布病的主要傳傳染源，該結(jié)果與全國(guó)布病病原體種/型分布一致[11]。因此，在畜牧業(yè)發(fā)展中，相關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)動(dòng)物(尤其是羊)間布病的防控。此外，流行病學(xué)調(diào)查資料顯示本研究中未能定種/型的2株菌GZ13CB和GZ13ZSX均分離自養(yǎng)牛從業(yè)人員血液標(biāo)本，提示上述2株不在AMOS-PCR檢測(cè)范圍內(nèi)的菌株為牛種布魯氏菌(牛種生物3、5、6、7、和9型)，但貴州省未見(jiàn)有牛種布魯氏菌的報(bào)道，是否為貴州省2013年新出現(xiàn)了牛種布魯氏菌的流行尚需要對(duì)上述兩株菌株進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定才能確定。

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Etiologic identification and analysis of the human brucellosis in Guizhou Province, China, 2013

LIU Ying,WANG Yue,MA Qing,LI Shi-jun,HUANG Yan,ZHOU Jing-zhu,YU Chun,TIAN Ke-cheng,TANG Guang-peng,WANG Ding-ming

(GuizhouProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Guiyang550004,China)

In order to etiologically diagnose and analyse the suspected patients of brucellosis and provide etiologic basis for the confirmation of patients and the control of human brucellosis in Guizhou Province, conventional and molecular techniques were used to identify suspicious bacteria strains isolated from the suspected patients of brucellosis. Results showed that a total of 13Brucellasuspicious bacteria strains were isolated and 11Brucellasuspicious strains were identified asB.melitensisbiotype 3 by conventional tests, with 2 strains unable to be identified. Genus specific BCSP31-PCR identified all the 13 bacteria strains asBrucellaspp. Species-specific AMOS-PCR further identified the 11 strains asB.melitensis, and the 2 strains unidentified with conventional tests were also unable to be identified with AMOS-PCR. Results of this study suggested thatB.melitensisbiotype 3 were the main epidemicBrucellain Guizhou Province in 2013, accounting for 84.6% (11/13), which provided etiological basis for the diagnosis of patients and the control of human brucellosis.

brucellosis; etiologic identification; PCR; Guizhou

Li Shi-jun, Email:zjumedjun@163.com

貴州省科技公關(guān)計(jì)劃社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(黔科合SY[2013]3049)和貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(黔科合J字[2013]2166號(hào))聯(lián)合資助

李世軍，Email：zjumedjun@163.com

貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴陽(yáng) 550004

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.01.010

R378.5

A

1002-2694(2015)01-0045-04

2014-06-10；

2014-10-23

Supported by the grant from the Science and Technology Projects for Social Development in Guizhou Province (No. SY[2013]3049) and the Program of Natural Science Foundation of Guizhou Provincial Government (No. J[2013]2166)