曾朝珍，康三江，張永茂，張霽紅，張 芳，張海燕

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，甘肅蘭州730070）

氯化銨及生物素對蘋果白蘭地揮發(fā)性香氣成分的影響

曾朝珍，康三江，張永茂，張霽紅，張 芳，張海燕

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，甘肅蘭州730070）

采用頂空固相微萃取(HS-SPME)-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)分析添加氯化銨及生物素與無添加氮源對照發(fā)酵蘋果白蘭地酒中的香氣成分。結(jié)果表明，250 mg/L氯化銨與10 μg/L生物素的交互作用使蘋果白蘭地發(fā)酵中酯類物質(zhì)的相對含量從40.95%提高至64.94%，異戊醇的相對含量從14.79%降低至3.69%；辛酸乙酯在主要酯類物質(zhì)中相對含量最高且隨著生物素添加量的增加從17.07%增加至22.43%，構(gòu)成了蘋果白蘭地特有的香味。

蘋果白蘭地；氯化銨；生物素；香氣成分

蘋果白蘭地是以蘋果為原料，經(jīng)破碎榨汁、酒精發(fā)酵、蒸餾、橡木桶陳釀、勾兌調(diào)配而成的蘋果蒸餾酒[1]。蘋果白蘭地與葡萄酒、果酒相比，具有以下特點：一是原料質(zhì)量要求低，可以大量利用非商品果，實現(xiàn)蘋果轉(zhuǎn)化增值；二是蒸餾取其精華，棄其糟泊，充分獲得發(fā)酵有益成分；三是節(jié)約糧食，緩解糧食危機，部分替代糧食酒，滿足消費者的高度酒需求。氮源及維生素是酵母生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)之一，蘋果汁中氮源的缺乏會導(dǎo)致發(fā)酵緩慢[2]。生物素的缺乏同樣如此，因為生物素與酵母的氮源代謝有關(guān)[3]。目前就關(guān)于氮源對蘋果白蘭地香氣成分影響研究表明，蘋果白蘭地發(fā)酵中添加氯化銨有助于提高主要酯類物質(zhì)的相對含量，降低異戊醇的相對含量[4]，而氮源及生物素交互作用對蘋果白蘭地香氣成分影響的研究報道較少。本實驗采用頂空固相微萃取（headspace solid-phase micro-extractions，HS-SPME）方法對蘋果白蘭地酒中的香氣成分進行萃取，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatohraph-mass spectrum，GC-MS）法進行分析研究，比較氮源及生物素交互作用對蘋果白蘭地生產(chǎn)過程中揮發(fā)性成分的影響，為改善和提高蘋果白蘭地酒的風味提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）1023及1620：中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院；富士蘋果：采自甘肅慶陽市；氯化銨（分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；偏重亞硫酸鈉（分析純）：無錫市晶科化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HS-SPME萃取裝置DVB/Carboxen/PDMS（50/30 μm）萃取器：美國Surpelco公司；TRACE DSQ型氣相——質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Finnigan公司；YXQ-LS-75G型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；PAL-1手持數(shù)顯糖度計：日本Atago公司；PZJ-0.5型榨汁機：江蘇科威機械有限公司；LRH-70型恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ZNHW2000型智能電熱套：上?？粕齼x器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蘋果白蘭地加工工藝流程

1.3.2 酵母菌種的活化

取液體種子培養(yǎng)基100 mL裝于250 mL三角瓶中，在無菌條件下每瓶接入酵母菌6環(huán)，28℃、150 r/min搖床培養(yǎng)48 h，4℃冰箱保存?zhèn)溆肹5]。

1.3.3 蘋果白蘭地酒制備

蘋果汁中添加250 mg/L氯化銨作為氮源及0、1 μg/L、10 μg/L三個水平的生物素并設(shè)置對照，取菌種濃度為106CFU/mL的兩種釀酒酵母以6%的接種量按比例1∶1接種于裝有600 mL蘋果汁的三角瓶中，然后控制溫度在20℃條件下發(fā)酵6 d。

1.3.4 分析方法

參照康三江等[4]對蘋果白蘭地揮發(fā)性香氣成分的分析方法對本研究樣品進行分析。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

由GC-MS分析得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)運用計算機譜庫在（NIST/WILEY）進行初步檢索及資料分析，再結(jié)合文獻進行人工圖譜解析[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理蘋果白蘭地酒中GC-MS總離子流色譜圖

采用固相微萃取法提取并利用GC-MS分析添加氮源及生物素和未添加氮源及生物素發(fā)酵蘋果白蘭地酒中的香氣成分，其GC-MS總離子流色譜圖如圖1～圖4所示。

2.2 不同處理發(fā)酵蘋果白蘭地香氣成分分析

未添加氮源和添加氯化銨及生物素發(fā)酵的蘋果白蘭地酒通過GC-MS測定分析的各香氣成分相對含量的鑒定結(jié)果如表1所示。

由表1可知，采用HP-SPME和通過GC-MS分析檢測并經(jīng)過計算機譜庫（NIST）進行初步檢索，未添加氮源發(fā)酵的蘋果白蘭地經(jīng)鑒定共測得32種揮發(fā)性香氣成分，其中酯類物質(zhì)16種，醇類物質(zhì)5種，羧酸類物質(zhì)3種，烯烴類物質(zhì)1種，烷烴類物質(zhì)5種，酮類物質(zhì)1種，其他香氣物質(zhì)1種，其相對含量依次分別為40.95%、31.22%、0.73%、0.55%、5.17%、0.04%、0.07%。

添加氯化銨發(fā)酵的蘋果白蘭地經(jīng)鑒定共測得29種揮

發(fā)性香氣成分，其中酯類物質(zhì)18種，醇類物質(zhì)5種，羧酸類物質(zhì)2種，烯烴類物質(zhì)1種，烷烴類物質(zhì)2種，其他香氣物質(zhì)1種，其相對含量依次分別為46.34%、28.67%、0.25%、0.54%、0.24%、0.11%。

添加氯化銨及1 μg/L生物素發(fā)酵的蘋果白蘭地經(jīng)鑒定共測得33種揮發(fā)性香氣成分，其中酯類物質(zhì)19種，醇類物質(zhì)5種，羧酸類物質(zhì)2種，烯烴類物質(zhì)2種，烷烴類物質(zhì)3種，酮類物質(zhì)1種，其他香氣物質(zhì)1種，其相對含量依次分別為51.38%、27.88%、0.35%、0.66%、0.16%、0.04%、0.08%。

添加氯化銨及10 μg/L生物素發(fā)酵的蘋果白蘭地經(jīng)鑒定共測得28種揮發(fā)性香氣成分，其中酯類物質(zhì)17種，醇類物質(zhì)5種，羧酸類物質(zhì)2種，烯烴類物質(zhì)1種，烷烴類物質(zhì)2種，其他香氣物質(zhì)1種，其相對含量依次分別為64.94%、13.87%、0.30%、6.68%、0.07%、0.04%。

2.3 不同處理蘋果白蘭地發(fā)酵主體香氣成分分析

2.3.1 不同處理蘋果白蘭地發(fā)酵主要呈香物質(zhì)相對含量

在GC-MS分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，對蘋果白蘭地酒中幾種主要呈香物質(zhì)的相對含量作了進一步分析，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，在空白組和添加氯化銨及生物素發(fā)酵的蘋果白蘭地中，酯類和醇類占的相對含量較高，構(gòu)成了不同處理條件下蘋果白蘭地發(fā)酵的主要香氣成分。不同處理發(fā)酵的蘋果白蘭地主體揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量因生物素添加量的增加而存在差異，隨著生物素添加量的增加，總的酯類物質(zhì)的相對含量依次增加，其相對含量分別為39.10%、44.72%、49.83%和63.33%。蘋果白蘭地發(fā)酵中添加氯化銨有助于提高主要酯類物質(zhì)的相對含量[4]，而生物素與酵母的氮源代謝有關(guān)[7]。生物素是丙酮酸羧化酶的輔助因子，這種酶能夠催化丙酮酸向草酰乙酸的轉(zhuǎn)化。草酰乙酸是α-酮戊二酸和天門冬氨酸的前體物質(zhì)，同時也是氮源同化及其他氮化合物合成的重要中間物質(zhì)。生物素與氨基酸代謝和脂合成有關(guān)[8]，其含量的改變可以影響酯類物質(zhì)的生成。

2.3.2 不同處理對蘋果白蘭地發(fā)酵主要酯類物質(zhì)含量的影響

不同處理對蘋果白蘭地發(fā)酵主要酯類物質(zhì)相對含量的影響如圖5所示。

由圖5可知，除了己酸乙酯與月桂酸乙酯以外，各處理與對照及處理組之間對各種酯的相對含量影響差異均顯著（P＜0.05）。對于辛酸乙酯和癸酸乙酯而言，二者受生物素影響變化趨勢一致，即其相對含量隨著生物素添加量的增加而增加。乙酸乙酯和乙酸己酯相對含量隨著生物素添加量的增大而減少且在生物素添加量為1 μg/L時相對含量最高，提高生物素添加量至10 μg/L時其相對含量降低，其相對值低于添加氯化銨卻高于空白對照；對于3-甲基-乙酸-1-丁酯相對含量變化具有與乙酸乙酯和乙酸己酯相似規(guī)律，但其生物素添加量為10 μg/L時的相對含量低于空白；而對于己酸乙酯而言，處理間雖然相對含量在生物素為1 μg/L時最大，但各處理己酸乙酯的相對含量均低于空白組，而月桂酸乙酯在生物素添加量為10 μg/L時相對含量最高且顯著增加。由圖5結(jié)果可知，辛酸乙酯的相對含量在所有酯中最高，辛酸乙酯略帶有玫瑰、橙子的花果香氣，是白蘭地酒特有的香味[9]。

2.3.3 不同處理對蘋果白蘭地發(fā)酵3-甲基-1-丁醇含量的影響

不同處理對蘋果白蘭地發(fā)酵3-甲基-1-丁醇相對含量的影響結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，對于3-甲基-1-丁醇（異戊醇）而言，添加氯化銨及生物素發(fā)酵的蘋果白蘭地酒中3-甲基-1-丁醇（異戊醇）的相對含量低于空白組，且3-甲基-1-丁醇（異戊醇）隨著生物素含量的增加而降低。異戊醇是高級醇的主要成分，但如含量過高，對人體會產(chǎn)生危害[10]。研究表明，外加氮源對高級醇的生成有很好的抑制作用[11]，可以降低3-甲基-1-丁醇（異戊醇）的相對含量[4]。高級醇可以通過氨基酸降解代謝路徑或糖合成代謝路徑生成[12-13]。而氨基酸和糖代謝途徑都包含需要生物素的生化反應(yīng)[14-15]。因此，生物素的缺乏可以影響銨態(tài)氮的利用，可以導(dǎo)致氨基酸合成和氮同化前體物質(zhì)α-酮戊二酸的生成不足，進而會導(dǎo)致相應(yīng)高級醇生成量的降低。

3 結(jié)論

結(jié)果表明，添加生物素進一步提高了蘋果白蘭地發(fā)酵中酯類物質(zhì)總的相對含量，降低了異戊醇的相對含量。250 mg/L氯化銨與10 μg/L生物素的交互作用使蘋果白蘭地發(fā)酵中酯類物質(zhì)的相對含量從40.95%升至64.94%，異戊醇的相對含量從14.79%降至3.69%；辛酸乙酯在主要酯類物質(zhì)中相對含量最高且隨著生物素添加量的增加從17.07%增至22.43%。

本實驗為了提高蘋果白蘭地酒精發(fā)酵效率及香氣成分的含量，就無機氮源與生物素在蘋果白蘭地發(fā)酵中對釀酒酵母代謝產(chǎn)物形成方面進行初步研究，而要探討更多的香氣成分形成對蘋果白蘭地品質(zhì)的作用，還需要進一步深入研究有機氮源、不同碳源、泛酸等營養(yǎng)物質(zhì)交互作用在蘋果白蘭地發(fā)酵中對釀酒酵母發(fā)酵特性的影響。

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Effect of ammonium chloride and biotin on the aromatic composition of apple brandy

ZENG Chaozhen,KANG Sanjiang,ZHANG Yongmao,ZHANG Jihong,ZHANG Fang,ZHANG Haiyan
(Agricultural Product Storage and Processing Research Institute,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730070,China)

The aromatic compositions of apple brandys with and without the addition of ammonium chloride and biotin were analyzed by HS-SPME and GC-MS.Results showed that with the addition of ammonium chloride 250 mg/L and biotin 10 μg/L,the relative content of esters increased from 40.95%to 64.94%in apple brandy;the relative content of isoamyl alcohol reduced from 14.79%to 3.69%.Ethyl caprylate with the highest relative content in the main esters increased from 17.07%to 22.43%with increasing biotin addition,which constituted the unique flavor of apple brandy.

apple brandy;ammonium chloride;biotin;aroma compounds

TS261.4

A

0254-5071（2015）06-0072-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.016

2015-05-05

農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金資助（CARS-28）；甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果蔬貯藏加工創(chuàng)新工程學(xué)科團隊項目（2014GAAS03）

曾朝珍（1981-），男，助理研究員，碩士，研究方向為食品發(fā)酵。