董 丹，王 猛，車振明，關(guān)統(tǒng)偉

（西華大學(xué)微生物研究所，食品生物技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610039）

甜瓣子發(fā)酵不同時(shí)期揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成分析

董 丹，王 猛，車振明，關(guān)統(tǒng)偉*

（西華大學(xué)微生物研究所，食品生物技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610039）

為研究甜瓣子在不同發(fā)酵時(shí)期風(fēng)味物質(zhì)的組成差異，本研究采用頂空固相微萃?。℉S-SPME）方法提取揮發(fā)性組分，再結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）檢測技術(shù)對(duì)分別發(fā)酵2月、4月、6月、8月甜瓣子進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，從4個(gè)不同時(shí)期甜瓣子樣品中檢測出7類共計(jì)148種化合物。其中酯類所占比例最高，其次是醇類、酸類和酚類。在4個(gè)不同時(shí)期都檢測出的物質(zhì)有34種，占總檢出化合物的22.82%，其中酯類13種，醇醚類7種，醛酮類5種，酸類2種，酚類2種，其他化合物類5種。

甜瓣子；風(fēng)味物質(zhì)；酯類；醇類；檢測

食品風(fēng)味的定義在現(xiàn)階段普遍使用的是HALL R L于1986年提出的定義，即食物客觀性質(zhì)使人產(chǎn)生的感覺印象的總和[1]。呈香物質(zhì)的產(chǎn)生主要有3種來源：（1）原材料中含有；（2）由米曲霉、耐鹽細(xì)菌、酵母等微生物代謝產(chǎn)生；（3）由非酶化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生[2]。郫縣豆瓣中的咸味來源于外添加的食鹽，鮮味來自原料被曲酶分解后產(chǎn)生的產(chǎn)物呈香表現(xiàn)，這些產(chǎn)物是由混合菌種中曲霉及根霉的蛋白酶、肽酶、谷氨酰胺酶作用水解原料中的蛋白質(zhì)生成的[3]。此外，發(fā)酵體系中的霉菌、酵母菌和細(xì)菌中的核酸，經(jīng)過核酸酶水解后生成多種核苷酸，其中鳥苷酸、肌苷酸和黃苷酸的鈉鹽的協(xié)調(diào)作用，增加了谷氨酸鈉鹽的鮮味數(shù)倍到十幾倍[4]。酸類物質(zhì)一般由乳酸菌產(chǎn)生，據(jù)研究，發(fā)酵過程中總酸呈現(xiàn)出先上升再下降回升的趨勢[5]。

目前國內(nèi)關(guān)于豆瓣的研究主要集中在通過菌種的改進(jìn)來進(jìn)行新工藝的優(yōu)化和新產(chǎn)品的研制上，而對(duì)其風(fēng)味方面的研究較少。國外對(duì)同類發(fā)酵調(diào)味品的研究已比較深入，如LEE K E等[6]研究了接種不同微生物生產(chǎn)的豆瓣醬產(chǎn)品之間的揮發(fā)性物質(zhì)的差異。對(duì)豆瓣中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定量和定性的分析以及豆瓣中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)隨豆瓣不同發(fā)酵時(shí)間的變化規(guī)律有重要的意義。本研究以甜瓣子（甜瓣子是蠶豆拌小麥粉經(jīng)制曲發(fā)酵6個(gè)月以上制成）在不同發(fā)酵時(shí)期的樣品為原料，采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）方法提取揮發(fā)性組分，結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）檢測技術(shù)對(duì)不同時(shí)期的甜瓣子進(jìn)行風(fēng)味物質(zhì)的檢測，從而探討甜瓣子在不同發(fā)酵周期，風(fēng)味物質(zhì)的形成及變化情況，以此為基礎(chǔ)來了解豆瓣風(fēng)味物質(zhì)形成的機(jī)理，從而完善豆瓣生產(chǎn)工藝中的關(guān)鍵控制點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆瓣瓣子：四川省成都市恒豐和食品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CS-700粉碎機(jī)：武義海納電器有限公司；15 mL頂空瓶：浙江愛吉任科技有限公司；JXX1-HH-2油浴鍋：揚(yáng)中市生化工電器有限公司；100 μm PDMS萃取頭：上海鴻澤企業(yè)發(fā)展有限公司；手動(dòng)SPME進(jìn)樣器：美國Supelco公司；QP2010plus氣質(zhì)色譜聯(lián)用儀：日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 HS-SPME萃取

準(zhǔn)確稱取研磨后的醬狀樣品5.00 g于15 mL頂空瓶中，于50℃恒溫平衡15 min。然后將按照供應(yīng)商推薦條件老化好的萃取頭插入頂部空間萃取45 min，完成后退回萃取頭，插入GC-MS進(jìn)樣品口，250℃下解吸3 min。萃取時(shí)SPME手柄插入頂空刻度設(shè)置為1；解吸時(shí)為使萃取頭達(dá)到進(jìn)樣口最熱部位，刻度設(shè)置為3。

1.3.2 GC-MS分析

氣相色譜條件：采用DB-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m× 0.25 mm×0.25 μm）用氦氣作載氣，流速1 mL/min；進(jìn)樣口溫度250℃；分流進(jìn)樣（5∶1）；升溫程序：起始溫度40℃（保持3 min），以10℃/min升至100℃，隨即再以8℃/min升至160℃（保持3 min），再以8℃/min升至200℃（保持3 min），最后以8℃/min升至230℃（保持7 min）。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子電離（electronic ionization，EI）源，電子轟擊能量70 eV；離子源溫度230℃；傳輸線溫度220℃；質(zhì)量掃描范圍25～450 amu。

1.3.3 揮發(fā)性化合物的定性定量分析

定性分析：將所測揮發(fā)性化合物的質(zhì)譜信息與美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）2011數(shù)據(jù)庫中已知揮發(fā)性化合物的質(zhì)譜信息進(jìn)行比對(duì)，選擇較高相似度（80%以上）的檢索結(jié)果，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的已知化合物確認(rèn)檢測成分。

定量分析：利用峰面積歸一化法，求得各揮發(fā)性化合物的相對(duì)百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS鑒定甜瓣子風(fēng)味物質(zhì)成分分析

通過HS-SPME結(jié)合GC-MS對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間（2月、4月、6月、8月）甜瓣子風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了鑒定分析，不同發(fā)酵時(shí)間甜瓣子經(jīng)GC-MS分析得到的總離子流色譜圖見圖1，各組分鑒定結(jié)果見表1。

由表1可知，從4個(gè)不同時(shí)期的甜瓣子中共檢測出148種揮發(fā)性物質(zhì)，其中包括酯類51種，醇類18種，醚類3種，醛類17種，酮類11種，酸類5種，酚類10種，烷烴類14種，其他類19種。

發(fā)酵2月甜瓣子中檢測出85種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中酯類27種，相對(duì)含量占31.81%，其中較高的成分是亞油酸乙酯（7.39%）；醇醚類16種，其相對(duì)含量占25.59%，其中較高的成分是苯乙醇（9.83%）；醛酮類14種，其相對(duì)含量占8.07%；酸類4種，相對(duì)含量占10.12%，其中較高的成分是乙酸（4.42%）、異戊酸（4.01%）；酚類3種，相對(duì)含量占4.26%；烷烴類10種，相對(duì)含量占4.73%，其中較高的成分是3-甲基戊烷（2.95%）；其他類11種。

發(fā)酵4月甜瓣子中檢測出58種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中酯類21種，相對(duì)含量占32.07%，其中較高的成分是亞油酸乙酯（10.05%）、棕櫚酸乙酯（7.01%）；醇類12種，相對(duì)含量占26.51%，其中較高的成分是苯乙醇（9.39%）；醛酮類10種，相對(duì)含量占7.73%，其中較高的成分是正戊醛2，5-辛二酮（4.22%）；酸類3種，相對(duì)含量占12.92%，其中較高的成分是乙酸（12.23%）；酚類5種，相對(duì)含量占13.81%，其中較高的成分是4-乙基-2-甲氧基苯酚（8.88%）；烷烴類1種；其他類6種。

發(fā)酵6月甜瓣子中檢測出75種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中酯類27種，相對(duì)含量占26.38%，其中較高的成分是油酸甲酯（5.42%）；醇醚類13種，相對(duì)含量占16.57%，其中較高的成分是苯乙醇（5.98%）、2-甲基-1-丁醇（3.56%）；醛酮類14種，相對(duì)含量占9.21%，其中較高的成分是異戊醛（1.83%）、2-甲基丁醛（1.34%）；酸類5種，相對(duì)含量占23.10%，其中較高的成分是乙酸（16.51%）；酚類5種，相對(duì)含量占14.17%，其中較高的成分是4-乙基-2-甲氧基苯酚（10.40%）；其他類11種。

發(fā)酵8月甜瓣子中檢測出84種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中酯類29種，相對(duì)含量占49.56%，其中較高的成分是棕櫚酸乙酯（12.80%）、亞油酸乙酯（10.37%）；醇醚類15種，相對(duì)含量占17.94%，其中較高的成分是2-甲基-1-丁醇（3.08%）、2，3-丁二醇（2.96%）、異丁醇（2.85%）；醛酮類14種，相對(duì)含量占4.29%；酸類3種，相對(duì)含量占7.13%，其中較高的成分是乙酸（4.02%）；酚類7種，相對(duì)含量占8.01%，其中較高的成分是4-乙基愈創(chuàng)木酚（3.09%）；烷烴類3種，相對(duì)含量占0.59%；其他類13種，相對(duì)含量占12.24%。

2.2 發(fā)酵過程中香氣成分的變化

不同發(fā)酵時(shí)間的豆瓣在香氣成分種類及含量上體現(xiàn)出不同的變化規(guī)律，結(jié)果見表2。

由表2可知，在發(fā)酵的初始階段（2～4月），酯類、醇類、醛酮類、酸類相對(duì)含量略微變化，基本平衡；相反，酚類物質(zhì)與烷烴類和其他類物質(zhì)的相對(duì)含量呈相增加的情況。在發(fā)酵至4～6月階段時(shí)，除了酯類、醇類、烷烴類含量呈減少趨勢，其中醇類減少幅度明顯，其余4類物質(zhì)相對(duì)含量都呈不同的增加趨勢，其中乙酸增加幅度特別大。在發(fā)酵至6～8月階段，酯類物質(zhì)相對(duì)含量增加了一倍，醛酮類、酚類、酸類含量減少，其中酸類減少幅度特別大，其余物質(zhì)略微變化，呈持平狀態(tài)。用具體數(shù)據(jù)說明發(fā)酵時(shí)間越長，風(fēng)味越好。

豆瓣的風(fēng)味物質(zhì)的形成主要來自酯類、醇類、醛酮類、酸類等。豆瓣在發(fā)酵過程中，由于蛋白酶的水解作用使得游離氨基酸增加，發(fā)生碳基和游離氨基酸的Mallard反應(yīng)和Streeker反應(yīng)[7-8]，形成酯、醇、醛、酚等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。豆瓣的主要呈香成分是酯類，酸和醇的酯化反應(yīng)是形成酯的主要反應(yīng)[9]，以高級(jí)脂肪酸酯為主[10]。酯類成分賦予郫縣豆瓣醬特殊的甜香、果香的同時(shí)，還可以很好的掩蓋產(chǎn)品中游離的脂肪酸帶來的不愉快的味道[11]。醇類，主要來自于微生物利用葡萄糖或氨基酸的代謝產(chǎn)物。醛類和酮類都是羰基類化合物，它們均屬不穩(wěn)定的中間體化合物，由醇氧化或酸還原形成。醛酮類物質(zhì)主要經(jīng)過脂質(zhì)氧化產(chǎn)生，也可能是用于郫縣豆瓣發(fā)酵的微生物的生長代謝產(chǎn)物，主要以花果香貢獻(xiàn)于郫縣豆瓣的風(fēng)味。酸類物質(zhì)主要以不愉快的味道貢獻(xiàn)于郫縣豆瓣的風(fēng)味，多數(shù)具有刺激性氣味，一般只起調(diào)和作用。酸類成分大部分應(yīng)該是在實(shí)驗(yàn)過程中由酯類水解產(chǎn)生[12]，以及乙酸菌等細(xì)菌發(fā)酵形成[13]。雖然烷烴和烯烴類化合物都有所檢出，但是烴類成分由于大多數(shù)不具有香味[14]，風(fēng)味閾值較高，對(duì)郫縣豆瓣的風(fēng)味的實(shí)際貢獻(xiàn)并不大。烯烴類風(fēng)味閾值較低，對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。胺類物質(zhì)主要是鄰甲基間羥基二苯胺，主要是通過氨基酸脫羧基形成[15]。雜環(huán)化合物，如吡啶、吡咯類所占的相對(duì)含量已經(jīng)很小了，但是它的呈味閾值也較小，一般具有發(fā)酵豆制品的獨(dú)特風(fēng)味，這對(duì)于豆瓣醬的醇厚風(fēng)味的形成有直接的影響[16-17]。

3 結(jié)論

本研究采用HS-SPME方法提取甜瓣子中的的揮發(fā)性組分，經(jīng)GC-MS分離鑒定出含有7類共計(jì)148種化合物，其中酯類、醇類、酚類組分的相對(duì)含量較高。

比較不同發(fā)酵時(shí)間的各類揮發(fā)性組分的變化趨勢表明，多種成分是發(fā)酵過程中產(chǎn)生的，尤其是酯類物質(zhì)相對(duì)含量及種類呈明顯增加趨勢，酯類物質(zhì)作為豆瓣中主要的呈香物質(zhì)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，對(duì)于酯類物質(zhì)的形成是有利的。醇類和酸類物質(zhì)作為在發(fā)酵過程中進(jìn)行的酯化反應(yīng)而消耗，其含量降低明顯，但種類沒有太大的變化。醛酮類物質(zhì)屬于羰基類不穩(wěn)定的中間體化合物，容易發(fā)生氧化或還原反應(yīng)，相對(duì)含量逐漸降低，種類幾乎沒有發(fā)生變化。而酚類物質(zhì)又是香氣中不可或缺的，隨著發(fā)酵的進(jìn)行相對(duì)含量及種類都呈現(xiàn)出了相對(duì)增加的趨勢。但其變化機(jī)理還需要進(jìn)一步的研究。

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Analysis of volatile flavor components from different periods of sweet soybean paste

DONG Dan,WANG Meng,CHE Zhenming,GUAN Tongwei*
(Key Laboratory of Food Biotechnology in Colleges and Universities in Sichuan Province,Institute of Microbiology, Xihua University,Chengdu 610039,China)

In order to study the difference of volatile flavor compounds of sweet soybean paste among different periods(two months,four months,six months,eight months),the volatile compounds were extracted by HS-SPME coupled with GC-MS.A total of 148 compounds divided into 7 subgroups were identified in sweet soybean paste of four periods,mainly including esters,alcohols,acids and phenols.There were 34 kinds of substances detected in four different periods,accounting for 22.82%of total detected compounds,including 13 esters,7 alcohol ethers,5 aldoketones, 2 acids,2 phenols,and 5 other compounds.

sweet soybean paste;flavor substance;esters;alcohols;determination

Q939.97

A

0254-5071（2015）06-0139-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.031

2015-05-11

教育部春暉計(jì)劃項(xiàng)目（No.13205639）；食品生物技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（No.Szjj2013-045）；四川省教育廳基金項(xiàng)目共同資助（No.13205688）

董丹（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称芳庸ぁ?/p>

*通訊作者：關(guān)統(tǒng)偉（1978-），副教授，博士，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。