劉 笑，侯順超，顧 林

（揚(yáng)州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127）

胡椒堿不同提取方法的比較研究

劉 笑，侯順超，顧 林*

（揚(yáng)州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127）

研究不同提取方法對(duì)白胡椒中胡椒堿含量測(cè)定的影響。利用紫外分光光度法測(cè)定胡椒堿含量，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，得到各種方法的最佳工藝參數(shù)，超聲法、酶法、超聲輔助酶法的提取率可分別達(dá)到5.798%、5.286%、6.439%，說明超聲輔助酶法對(duì)胡椒堿提取效果最優(yōu)。

胡椒堿；超聲；酶法；超聲輔助酶法；提取

胡椒（Piper nigrum L.）始載于唐朝蘇恭的《唐木草》，又名白川、浮椒，是胡椒科胡椒屬常綠藤本植物[1]。原產(chǎn)于印度，素有“熱帶香料之王”的稱號(hào)，西漢時(shí)期傳入我國，如今已成為海南的特色產(chǎn)業(yè)[2]。白胡椒既是餐桌上不可或缺的調(diào)味品，又是生活中人們調(diào)理身體的常用中藥，在食品、化學(xué)和醫(yī)藥工業(yè)中都有著廣泛的應(yīng)用。雖然白胡椒中揮發(fā)油含量及所含的化學(xué)成分低于黑胡椒，但在藥用價(jià)值和臨床應(yīng)用方面，以白胡椒作用較佳[3]，尤其在驅(qū)寒除濕、健胃保肝方面，功效更為顯著。胡椒果實(shí)中的主要辣味成分胡椒堿具有抗炎抑菌[4-5]、抗氧化[6]、降血脂[7]等活性，對(duì)白癜風(fēng)[8]、心肌缺血[9]、抑郁癥[10]等疾病有一定療效，更有潛力被開發(fā)為新的抗癌藥物[11-13]。

目前胡椒堿的提取方法主要有酸水法[14]、有機(jī)溶劑法[15-16]、超聲法[17-18]、超臨界CO2萃取法[19-20]和微波減壓蒸餾法[21]等。酸水法提取率低；超臨界CO2萃取法雖然效率高，但技術(shù)要求嚴(yán)格，投資成本大；微波輔助法簡(jiǎn)單可靠，對(duì)于胡椒堿的提取還有待進(jìn)一步研究；超聲法是目前儀器輔助萃取中最為常用的方法，時(shí)間短、得率高，且溶劑用量少。本試驗(yàn)通過單因素及其優(yōu)化試驗(yàn)分別研究超聲法、酶法及超聲輔助酶法提取白胡椒中胡椒堿的工藝，采用紫外（ultraviolet，UV）分光光度法進(jìn)行測(cè)定與比較，為進(jìn)一步開發(fā)胡椒資源提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白胡椒：購于海南儋州市；纖維素酶（30 U/mg）：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；磷酸氫二鈉、檸檬酸：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；胡椒堿標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）：天津一方科技有限公司；無水乙醇（分析純）：上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；FW100高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；GZX-GF101-2-BS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；UV-7504C紫外分光光度計(jì)：上海欣茂儀器有限公司；KQ-200KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理[16]

稱取適量白胡椒置于50℃烘箱中恒溫干燥48 h，粉碎過100目篩，得到白胡椒粉備用。

1.3.2 超聲提取胡椒堿的工藝優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取3.000 g白胡椒粉于250 mL錐形瓶中，按一定料液比加入無水乙醇浸泡，暗處靜置1 h，超聲提取后抽濾得到濾液，即為胡椒堿提取液。

通過單因素試驗(yàn)對(duì)料液比、超聲時(shí)間、溫度及功率進(jìn)行研究，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇3因素5水平進(jìn)行二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)[22]，最終確定超聲提取胡椒堿的最佳工藝參數(shù)。

1.3.3 酶法提取胡椒堿的工藝優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取3.000 g白胡椒粉和一定量纖維素酶于250 mL錐形瓶中，加入一定pH的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液60 mL，置于恒溫水浴鍋中酶解，抽濾后濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入適量無水乙醇溶解保存；濾渣烘干后加入60 mL無水乙醇于恒溫水浴鍋中浸提，冷卻后抽濾，兩次濾液合并搖勻，即為胡椒堿提取液。

通過單因素試驗(yàn)對(duì)酶量、緩沖液pH、酶解時(shí)間及溫度4個(gè)因素進(jìn)行研究，并根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，最終確定酶法提取胡椒堿的最優(yōu)工藝條件。

1.3.4 超聲輔助酶法提取胡椒堿的工藝優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取3.000 g白胡椒粉和一定量纖維素酶于250 mL錐形瓶中，加入一定pH的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液60 mL，置于恒溫水浴鍋中浸泡后超聲，提取液抽濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入適量無水乙醇溶解保存；濾渣烘干后加入60 mL無水乙醇浸泡，暗處靜置1 h，超聲提取后抽濾得到濾液，兩次濾液合并搖勻，即為胡椒堿提取液。

考察酶量、緩沖液pH、超聲時(shí)間及溫度4個(gè)因素對(duì)胡椒堿提取率的影響，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果利用Design Expert （version8.05）軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，以胡椒堿提取率為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)[23]，最終確定超聲輔助酶法提取胡椒堿的最優(yōu)工藝參數(shù)。

1.3.5 胡椒堿含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取15 mg胡椒堿標(biāo)品，無水乙醇定容至100 mL，分別取200μL、400μL、600μL、800μL、1 000μL、1 200μL、1 400μL于25 mL容量瓶中，無水乙醇定容，得到質(zhì)量濃度分別為1.2 mg/L、2.4 mg/L、3.6 mg/L、4.8 mg/L、6.0 mg/L、7.2 mg/L、8.4 mg/L的胡椒堿溶液，以無水乙醇作參比，于波長342 nm處測(cè)吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.120 3x+0.001 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6。

稀釋至一定倍數(shù)的提取液于波長342 nm處測(cè)吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出胡椒堿質(zhì)量濃度，從而得到胡椒堿提取率。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲提取胡椒堿試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以胡椒堿提取率（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取料液比1∶20（g∶mL），對(duì)超聲時(shí)間、溫度、功率進(jìn)行3因素5水平二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)因素及水平見表1，結(jié)果見表2。

利用DPS統(tǒng)計(jì)軟件經(jīng)二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到白胡椒堿提取率對(duì)3個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸方程：

對(duì)該結(jié)果進(jìn)行方差分析可知，失擬性差異不顯著，回歸方程顯著，對(duì)實(shí)際試驗(yàn)擬合較好。并且功率（X1）、時(shí)間（X2）對(duì)胡椒堿的提取率在α＝0.01水平顯著，3個(gè)因素對(duì)胡椒堿得率的影響順序?yàn)闀r(shí)間＞功率＞溫度。采用頻率分析法尋找最優(yōu)提取工藝參數(shù)，在95%的置信區(qū)間內(nèi)胡椒堿得率＞5.48%的優(yōu)化提取條件為功率162.84～187.24 W，時(shí)間65.19～70.64 min，溫度48.20～54.52℃，取優(yōu)化條件的平均值，并考慮實(shí)際操作，得到超聲波提取胡椒堿優(yōu)化工藝條件為料液比1∶20（g∶mL），功率180 W，超聲時(shí)間68 min，溫度51℃，在此條件下提取率可以達(dá)5.798%，與理論值的5.79%相近。

2.2 酶法提取胡椒堿試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以胡椒堿提取率（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取酶量6 mg，對(duì)超緩沖液pH、酶解溫度、時(shí)間進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)因素及水平見表3，試驗(yàn)結(jié)果見表4。

由表4可知，3個(gè)因素對(duì)胡椒堿提取率的影響順序?yàn)闇囟龋緋H＞時(shí)間，確定酶法提取胡椒堿優(yōu)化工藝條件為酶量6 mg，酶解溫度50℃，時(shí)間6 h，緩沖液pH 7，在此條件下提取率可達(dá)5.286%。

2.3 超聲輔助酶法提取胡椒堿試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以胡椒堿提取率（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取溫度為60℃，對(duì)超聲時(shí)間、緩沖液pH、酶量進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)因素及水平見表5，結(jié)果見表6。

利用Design Expert8.05軟件對(duì)表6數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到胡椒堿對(duì)3個(gè)因素的二次多元回歸方程：

對(duì)該結(jié)果進(jìn)行方差分析，失擬性差異不顯著，回歸方程高度顯著，說明模型有效。3個(gè)因素對(duì)胡椒堿提取率影響大小的排序?yàn)槌晻r(shí)間＞緩沖液pH＞酶量。由響應(yīng)面軟件分析可知，在酶量6.76 mg，緩沖液pH 6.34，溫度60℃，超聲時(shí)間60 min的條件下，胡椒堿提取率最大，提取率可達(dá)6.439%，與理論值6.447%相近。

綜上所述，采用UV法測(cè)定不同提取方法的胡椒堿含量，超聲輔助酶法最高，其次是超聲法，酶法最低，說明超聲輔助酶法能大大提高白胡椒中胡椒堿得率，提取效果較優(yōu)。

3 結(jié)論

采用不同方法提取白胡椒中胡椒堿，利用UV法測(cè)定胡椒堿含量，分別在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，得到各種方法的最佳工藝參數(shù)。超聲法的最優(yōu)提取工藝為料液比1∶20（g∶mL），功率180 W，超聲時(shí)間68 min，溫度51℃，提取率最大可達(dá)5.798%；酶法在酶量6 mg，酶解溫度50℃，時(shí)間6 h，緩沖液pH 7的條件下，提取率可達(dá)5.203%；超聲輔助酶法在酶量6.76 mg，緩沖液pH值為6.34，溫度60℃，超聲時(shí)間60 min的條件下，提取率可達(dá)6.439%。結(jié)果表明，3種方法對(duì)胡椒堿提取效果順序?yàn)槌曒o助酶法＞超聲法＞酶法，為胡椒的深加工提供一些理論依據(jù)。

[1]劉 杰，楊春亮，章程輝，等.胡椒堿的功能及萃取工藝研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2009（2）：48-51.

[2]李 明.我國胡椒初加工的現(xiàn)狀與分析[J].廣西熱帶農(nóng)業(yè)，2004（1）：37-39.

[3]鄭品梅，鄒綱明，李彥威.胡椒油的研究進(jìn)展[J].食品科技，2007（1）：25-28.

[4]BAIYF,XU H.Protective action ofpiperine againstexperimentalgastric ulcer[J].Acta Pharmacol Sin,2000,21(4):357-359.

[5]葛 暢.胡椒抑菌活性物質(zhì)的研究[D].海口：海南大學(xué)碩士論文，2011.

[6]劉 笑，包振偉，顧 林，等.胡椒油樹脂抗氧化性及抑菌性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（9）：2731-2734.

[7]包蘭蘭，金 樁，博·格日勒?qǐng)D.胡椒堿降血脂作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2004（1）：22-23.

[8]馬慧軍，朱文元，王大光，等.中藥單體胡椒堿促進(jìn)表皮黑素細(xì)胞黑素合成的實(shí)驗(yàn)研究[J].臨床皮膚科雜志，2005，34（1）：14-16.

[9]于騰飛，劉 屏，王東曉，等.胡椒堿對(duì)過氧化氫損傷大鼠心肌線粒體的保護(hù)作用及機(jī)制研究[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2008，24（1）：7-9.

[10]崔廣智，金樹梅.胡椒堿抗抑郁作用研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，12（7）：42-43.

[11]SUNILA E S,KUTTAN G.Immunomodulatory and antitumor activity of Piper longum Linn.and piperine[J].J Ethnopharmacol,2004,90 (2-3):339-346.

[12]梁愛華.傳統(tǒng)民間藥物的腫瘤化學(xué)預(yù)防作用（15）：白胡椒及胡椒堿在體內(nèi)及體外致癌試驗(yàn)中的抗促癌作用[J].國際中醫(yī)中藥雜志，1998（6）：34-35.

[13]WANG Q Q,LAIL H,FU Q H,etal.Piperine suppresses tumor growth and metastasis in vitro and in vivo in a 4T1 murine breastcancer model [J].Acta Pharmacol Sin,2012,33(4):523-530.

[14]KANAKIIN,DAVE M,PADH H,etal.A rapid method for isolation of piperine from the fruits of Piper nigrum Linn[J].J Nat Med,2008,62 (3):281-283.

[15]柳 中，李銀聰.索氏法提取白胡椒油樹脂的工藝研究[J].食品與發(fā)酵科技，2011，47（1）：65-67，70.

[16]包振偉，顧 林，白東輝，等.響應(yīng)面法優(yōu)化黑胡椒油樹脂提取工藝[J].食品科學(xué)，2013，34（14）：17-21.

[17]方 杰，趙慶軍，孟 旭.超聲提取白胡椒油樹脂的工藝研究[J].中國食品添加劑，2008（4）：57-59，63.

[18]張明楠，周雪晴，梁振益.不同胡椒粉中胡椒堿的含量比較[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，31（8）：85-88.

[19]YAMAGUCHIT，KAMEZAWA K，IWAYAK，等.在線超臨界流體萃取-超高效液相色譜-光電二極管檢測(cè)器聯(lián)用分析胡椒粉中的胡椒堿[J].生命科學(xué)儀器，2011，9（4）：29-32.

[20]張偉晶，王立紅，費(fèi)大龍.胡椒超臨界CO2萃取物中胡椒堿分離工藝的研究[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010（13）：71-72.

[21]王友志，王曉青，姚 亮，等.微波提取胡椒堿的工藝研究[J].海南師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，24（3）：293-296.

[22]孫志高，蔣國玲，張萌萌，等.二次正交旋轉(zhuǎn)組合優(yōu)化微波輔助提取溫州蜜柑β-隱黃素工藝[J].食品科學(xué)，2013，34（8）：16-20.

[23]王金璽，包振偉，劉 笑，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化平菇多糖提取工藝[J].中國釀造，2013，32（4）：108-112.

Comparative study on different extraction methods for piperine

LIUXiao,HOUShunchao,GU Lin*

(College of Food Science and Engineering,Yangzhou University,Yangzhou 225127,China)

The effectof differentextraction methods on piperine extraction from white pepper was studied.Ultravioletspectroscopy was used to analyze the piperine content.The optimalprocess conditions were explored on the basis ofsingle factor tests,and the optimalparameters were acquired. The piperine yield by ultrasonic extraction,enzymatic extraction and ultrasonic-assisted enzymatic extraction was 5.798%,5.286%,6.439%,respectively.The results showed thatultrasonic-assisted enzymatic extraction forpiperine was betterthan others.

piperine;ultrasonic;enzymatic method;ultrasonic-assisted enzymatic method;extraction

S509.9；TS202.3

A

0254-5071（2015）02-0047-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.011

2014-12-25

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAD33B01）

劉 笑（1991-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。

*通訊作者：顧 林（1956-），男，教授，本科，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。