吳成勇 楊滿 林梅 蔡敏生 王錦華 溫雪珍廣東省梅州市人民醫(yī)院生殖中心，廣東梅州514031

小鼠卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射改良技術在輔助生殖技術應用中的價值

吳成勇 楊滿 林梅 蔡敏生 王錦華 溫雪珍
廣東省梅州市人民醫(yī)院生殖中心，廣東梅州514031

目的研究鼠卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（ICSI）改良技術在人類輔助生殖技術應用中的價值。方法將小鼠分為兩組：采用固定人卵子的固定針組（C-ICSI組）和改良的喇叭型固定針組（N-ICSI組），觀察兩組ICSI操作后卵子存活數(shù)、卵裂情況。結果N-ICSI組卵子存活率為77.4%，明顯高于C-ICSI組的7.8%，差異有高度統(tǒng)計學意義（χ2=483.183，P＜0.01）；兩組正常受精率及異常受精率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。N-ICSI組卵裂數(shù)為97.3%，明顯高于C-ICSI組的80.0%，差異有高度統(tǒng)計學意義（χ2=18.399，P＜0.01），桑葚胚、囊胚和孵化的胚胎比例差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論改良的小鼠ICSI技術，可以明顯提高操作時卵子的存活率，這將為人類實驗室ICSI技術的質(zhì)量控制和研究提供保障，同時，該項研究成果可以分析人精子激活卵母細胞的能力和人精子的核型，因此有重要的研究價值。

昆明小鼠；卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射；存活率

近年來，不孕不育的患者呈現(xiàn)出逐年增加趨勢，據(jù)報道，我國的不孕發(fā)生率約為12.5%［1］。部分患者通過治療雖能懷孕，但仍有患者由于輸卵管堵塞、嚴重少弱畸精癥甚至無精子癥等需要輔助生殖技術治療，如體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）、卵母細胞胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）等。實驗室胚胎培養(yǎng)是直接關系著輔助生殖技術成功與否的關鍵環(huán)節(jié)，因此，做好實驗室質(zhì)量控制，為配子發(fā)育與胚胎培養(yǎng)提供良好的環(huán)境顯得至關重要［2］。有文獻報道，昆明小鼠IVF-ET技術對實驗室的環(huán)境監(jiān)測、耗材質(zhì)控方面提供了重要的價值，為人類IVF-ET技術的不斷完善和臨床妊娠率的不斷提高作出了巨大貢獻［3］。但是尚無關于小鼠ICSI在實驗室質(zhì)量管理和價值研究的報道。考慮由于人類卵子和小鼠卵子的差異，小鼠卵子通過人類ICSI操作系統(tǒng)難以順利完成，單精子注射時卵子極易崩解［4-5］。因此，本研究在不改變實驗室環(huán)境，ICSI操作系統(tǒng)的前提下，對細節(jié)部分進行改良，以期利用改良的小鼠ICSI技術能為人類ICSI技術的發(fā)展和實驗室ICSI技術的質(zhì)量控制提供價值，現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物清潔級昆明小鼠均購自廣東省實驗動物中心，其中4～6周齡雌鼠50只，8～12周齡雄鼠20只。

1.2 實驗試劑及設備

孕馬血清促性腺激素（PMSG）、注射用人絨毛膜促性腺激素（HCG）均購自寧波市三生藥業(yè)有限公司。取卵-胚胎處理液（G-MOPS）、洗精受精液（IVF）、卵裂胚培養(yǎng)液（G-1）、囊胚培養(yǎng)液（G-2）均購自瑞典vitrolife公司。培養(yǎng)皿、吸管購自美國Falcon公司。設備：丹麥IVF tech工作站、奧林巴斯（型號：LSZX10）及尼康（型號：SMZ1000）解剖顯微鏡、奧林巴斯導致顯微鏡（型號IX71）、Apendorf顯微操作系統(tǒng)、ASTEC三氣培養(yǎng)箱、CO2氣體檢測儀、溫度測定儀等。

1.3 實驗方法

1.3.1 促排卵及卵子準備選擇4～6周齡雌性昆明小鼠，于17：00時腹腔注射PMSG 10 U，48 h后腹腔注射HCG 10 U，14～16 h后采集卵子。卵子準備具體步驟：①頸部脫臼處死昆明小鼠，腹部用75%酒精清潔消毒，逐層打開腹腔，取出卵巢與子宮之間的輸卵管組織，放入預恒溫的G-MOPS液中；②在解剖顯微鏡下找到輸卵管膨大的壺腹部（透亮），用1mL注射器針頭劃破膨大部，流出卵丘復合物組織；③吸出卵丘復合物組織依次放入4孔板的IVF液體中，后保存于第4孔，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h；④準備4孔板，1孔中加入透明質(zhì)酸酶0.5 mL（80 U/mL），2、3、4孔中加入0.6 mL IVF液體，均用石蠟油覆蓋，預溫2 h后，卵丘復合物放入1孔透明質(zhì)酸酶中消化1 min，取出卵子周圍的顆粒細胞，后依次在2、3、4孔中洗滌，去除透明質(zhì)酸酶，完成卵子準備工作。

1.3.2 精子準備①選擇8～12周齡雄性昆明小鼠，頸部脫臼處死，腹部酒精清潔消毒，打開腹腔，取出附睪尾部組織，放入預恒溫的G-MOPS液中。②將附睪尾洗滌后，放入另一有G-MOPS的培養(yǎng)皿中，用1mL注射器針頭刺破附睪尾部組織，放入CO2培養(yǎng)箱孵育15min。③準備好15mL離心管，加入2mL濃度為80%的精子梯度離心液，吸出游離出精子的G-MOPS液，緩慢加入到精子梯度離心液上面，可見清晰的分層，300～600 g離心15 min。④吸出精子沉淀，用IVF液洗滌2次，完成精子制備。

1.3.3 卵母細胞胞漿內(nèi)單精子注射操作步驟①根據(jù)固定針的使用不同將ICSI操作分為兩組：傳統(tǒng)固定人類卵子的固定針組（C-ICSI組）和改良的固定針組（N-ICSI組）。C-ICSI組固定人卵的固定針通過商業(yè)化購買。N-ICSI組固定針通過自制完成：選擇外徑1.0mm、內(nèi)徑0.75 mm的玻璃管，通過拉針儀和鍛針儀拉制端口內(nèi)徑為45～50μm，開口呈喇叭形的固定針。注射針均選擇商業(yè)化的ICSI注射針。在顯微操作系統(tǒng)上裝好固定針和注射針。②ICSI操作皿的準備：取顯微操作皿，中心偏上部位做30μL左右的沖洗滴，以皿的中心為中點做一豎條形的PVP操作滴，再接著以PVP操作滴為對稱軸分別在其兩側(cè)用G-MOPS做若干10μL左右的卵子操作滴，覆蓋4mL礦物油后移至桌面培養(yǎng)箱或溫箱中預熱2 h。③PVP操作滴加入1滴精子懸液，卵子操作滴中加入卵子（3～5個/滴）。④注射針對精子進行斷尾，吸取精子頭，固定針固定卵子，使紡錘體位于6點鐘位置，注射針3點鐘處注射精子進入卵子內(nèi)。⑤操作結束后，用IVF液洗滌卵子后，放入37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4 觀察指標

注射后7 h左右觀察雙原核情況，記錄存活卵子數(shù)、正常受精卵子、異常受精卵子，24 h后觀察卵裂情況，72 h觀察桑葚胚，96 h觀察囊胚發(fā)育、囊胚孵化情況。正常受精比例=正常受精卵子數(shù)/存活卵子數(shù)× 100%；異常受精比例=異常受精卵子數(shù)/存活卵子數(shù)× 100%。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩種卵母細胞胞漿內(nèi)單精子注射操作方法

C-ICSI組采用固定人卵子的固定針進行ICSI操作。N-ICSI組采用自制完成的固定針進行操作：開口呈喇叭形。見圖1。

2.2 卵子存活率與受精率比較

N-ICSI組卵子存活率明顯高于C-ICSI組，差異有高度統(tǒng)計學意義（χ2=483.183，P＜0.01），而兩組正常受精率及異常受精率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 胚胎發(fā)育情況的比較

N-ICSI組卵裂數(shù)明顯高于C-ICSI組，差異有高度統(tǒng)計學意義（χ2=18.399，P＜0.01）；兩組桑葚胚、囊胚和孵化的胚胎比例比較，差異均無統(tǒng)計學意義（χ2= 2.544、3.075、1.938，均P＞0.05）。見表2。

3 討論

人類胚胎實驗室是精子、卵子受精和胚胎發(fā)育的體外培養(yǎng)場所。實驗室內(nèi)與精子、卵子和胚胎接觸的環(huán)境直接影響著它們的發(fā)育和培養(yǎng)質(zhì)量，直接關系著輔助生殖技術的成功，如實驗室的空氣質(zhì)量、濕度和溫度；培養(yǎng)液的pH值、營養(yǎng)物質(zhì)和滲透壓；培養(yǎng)皿的毒性和雜質(zhì)；培養(yǎng)箱的CO2和O2濃度等的異常都可導致精卵體外受精失敗和胚胎發(fā)育障礙［6-7］。因此，加強胚胎實驗室監(jiān)測和管理，創(chuàng)造一個適宜穩(wěn)定的實驗室培養(yǎng)環(huán)境對提高輔助生殖技術，提高生殖中心整體水平具有重要的作用。有學者報道了小鼠IVF-ET技術可以用于檢測實驗室的質(zhì)量，這為生殖醫(yī)學中心IVF-ET技術的環(huán)境穩(wěn)定提供了保障［8-9］。但是，尚無文獻報道關于ICSI技術的實驗室質(zhì)量控制。

ICSI技術從一開始就應用于人的臨床治療，未進行動物實驗研究，因此，對于ICSI應用于臨床治療的風險性尚無法得到有效評估［10］。ICSI操作時，是將人工制作的注射針穿刺卵細胞，可能對卵細胞的骨架結構、微絲微管結構造成損傷，并將這些損傷的缺陷傳給下一代［11-12］。再則，注射針注入的精子不像自然狀態(tài)下的受精過程，自然情況下精子通過陰道、宮頸、子宮、輸卵管等多個管道才能到達受精部位，這中間存在多個篩選屏障，只有質(zhì)量足夠優(yōu)良的精子才能越過這些屏障，因此，起到了優(yōu)勝劣汰的作用。ICSI技術是通過注射針人為地挑選出表觀尚正常的精子注入進卵子內(nèi)，這可能將有遺傳缺陷的精子注入卵細胞內(nèi)［13］。因此，尋找研究ICSI技術及其質(zhì)量控制的動物模型顯得十分必要。

小鼠動物模型價格便宜，且小鼠攜帶著豐富的遺傳信息，小鼠卵子容易獲得，因此是比較理想的ICSI模型，但是小鼠的卵子比人的卵子小，對外界損傷的刺激特別是穿刺刺激較敏感，容易崩解，因此臨床中對小鼠動物模型進行ICSI研究進展艱難［14-15］。鄧利［16］采用傳統(tǒng)ICSI方法進行小鼠實驗，發(fā)現(xiàn)注射后卵子存活率僅為22%，成囊率僅為20%。本研究中C-ICSI組的卵子存活率更低，僅為7.8%，其余大部分均由于注射后胞漿內(nèi)物質(zhì)流出細胞外死亡，成囊率為38.3%。表明用人的ICSI操作系統(tǒng)進行小鼠實驗，卵子損傷嚴重，注射部位的卵胞膜受損后，無法自然恢復，導致細胞破裂死亡。苗聰秀等［17］采用改良ICSI方法進行小鼠實驗，即使用自制的喇叭型固定針進行ICSI操作，結果卵子存活率達到83.7%，卵裂率達到91.1%。采用改良固定針，不改變實驗室的其他環(huán)境，與人類的ICSI技術非常相似，小鼠ICSI動物實驗成功率明顯提高。與傳統(tǒng)的ICSI技術相比，改良的ICSI技術能使受損的卵細胞膜有充足的時間修復，因此成活率大大提高。這種可靠的ICSI改良技術，可以廣泛用于生殖中心實驗室關于ICSI技術的質(zhì)量控制和科學研究，不斷發(fā)展和提高人類ICSI技術。不僅如此，改良的ICSI技術還可以檢測精子的受精能力。例如，臨床中經(jīng)常遇到一些不孕夫婦，取出的卵子數(shù)較多，且質(zhì)量較好，但進行體外受精時無一卵子受精。這類患者可以采用改良的ICSI技術，將這類患者的精子注入進老鼠的卵細胞內(nèi)，研究患者的精子激活鼠卵的能力，并對分裂的受精卵進行研究，分析人精子的核型異常情況［18］。

改良的小鼠ICSI技術，可以明顯提高操作時卵子的存活率，這將為輔助生殖技術的發(fā)展和研究和人類實驗室ICSI技術的質(zhì)量控制提供保障，同時，可以利用該項研究成果，對人精子激活卵母細胞的能力進行研究，分析人精子的核型。因此，改良的小鼠ICSI技術對人類輔助生殖技術的不斷發(fā)展有著重要的價值，值得進一步研究和應用。

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The value of im proved ICSI technology in themouse in the human assisted reproductive technology

WU Chengyong YANGMan LIN Mei CAIMinsheng WANG Jinhua WEN Xuezhen
Reproductive center,the People's Hospital of Meizhou City,Guangdong Province,Meizhou 514031,China

ObjectiveTo study the value of improved technology ICSI in themouse in the human assisted reproductive technology.M ethodsThe ICSIoperation were divided into two groups:ICSIoperation with holding pipette for holding human ova(C-ICSIgroup)and with improved holding pipette(N-ICSIgroup),ova survival and cleavage in the two groups were observed after ICSI operation.ResultsThe rate of ova survival in the N-ICSI group was 77.4%,significantly higher than that in the C-ICSIgroup(7.8%),there was statistically significant(χ2=483.183,P＜0.01).About the normal fertilization rate and abnormal fertilization rate,there was no significant difference(P＞0.05).The number of cleavage in the N-ICSIgroup was 97.3%,significantly higher than that in the C-ICSIgroup(80.0%),therewas statistically significant difference(χ2=18.399,P＜0.01).There was no significant difference about themorula,blastocyst and hatching embryo(P＞0.05).ConclusionThemodified ICSI technique in themouse can significantly improve the survival rate of ova,which will provide the guarantee for quality control and research of human laboratory of ICSI technology,at the same time,the research can analyze the ability of human sperm for oocyte activation and karyotype analysis of human sperm,therefore there is an important research value.

Kunmingmice;Intracytoplasmic sperm injection;Survival rate

R711.6 [

]A [

]1673-7210（2015）01（a）-0008-04

2014-09-30本文編輯：任念）

廣東省梅州市科技計劃項目醫(yī)研、科教類（第二批）（編號2014B99）。

[作者簡介]吳成勇（1981-），男，碩士；研究方向：生殖醫(yī)學。