張亮，錢智磊，陸磊，侯文潔，丁紅梓，王潔

(南京市胸科醫(yī)院，南京210029)

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同時(shí)測定血漿INH、AcINH、RFP和PZA的高效液相色譜法建立及其在肺結(jié)核患者中的應(yīng)用

張亮，錢智磊，陸磊，侯文潔，丁紅梓，王潔

(南京市胸科醫(yī)院，南京210029)

摘要：目的建立同時(shí)測定血漿異煙肼(INH)、乙酰異煙肼(AcINH)、利福平(RFP)、吡嗪酰胺(PZA)的高效液相色譜法(HPLC)，并驗(yàn)證其在肺結(jié)核患者中的應(yīng)用效果。方法HPLC色譜柱為Waters Xselect-HSS T3(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈和磷酸二氫鉀為流動相，柱溫40 ℃，流速0.8~1.0 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL。同時(shí)進(jìn)樣含INH、AcINH、RFP、PZA對照品的血漿，檢驗(yàn)方法的專屬性、線性關(guān)系、精密度和準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性及回收率。取聯(lián)合服用INH、乙胺丁醇、RFP和PZA的10例肺結(jié)核患者的血漿樣本，采用上述HPLC測定INH、AcINH 、RFP和PZA的血藥濃度。結(jié)果血漿樣本中INH、AcINH、RFP和PZA各組分有較好的分離，互不干擾；在線性范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好(r2>0.99)；日內(nèi)、日間精密度均<10%；穩(wěn)定性較好；回收率為80%~120%。肺結(jié)核患者中除1例AcINH和1例RFP血藥濃度低于線性范圍外，其余數(shù)據(jù)均在線性范圍內(nèi)。結(jié)論成功建立了同時(shí)測定血漿INH、AcINH、RFP、PZA的HPLC方法，該方法專屬性好，樣品處理簡單，符合生物樣品分析要求。

關(guān)鍵詞：結(jié)核??；高效液相色譜法；異煙肼；利福平；吡嗪酰胺；乙酰異煙肼；血藥濃度

結(jié)核病是一種在全世界范圍內(nèi)流行的傳染性疾病，每年可導(dǎo)致百萬患者死亡[1]。同時(shí)服用異煙肼(INH)、利福平(RFP)和吡嗪酰胺(PZA)、乙胺丁醇是初治結(jié)核病的首選方案[2~4]，該方案在大部分患者中療效較好。但是，少部分患者由于血中藥物濃度過低而導(dǎo)致治療失敗。乙酰異煙肼(AcINH)是INH在肝臟內(nèi)最主要的乙?；x產(chǎn)物，根據(jù)乙?；饔玫牟町惙譃榭齑x型和慢代謝型[5]，不同代謝類型的治療效果和不良反應(yīng)不同。通過監(jiān)測血液中AcINH濃度來判斷其乙?；念愋?，并以此為依據(jù)調(diào)整INH的給藥劑量，對增強(qiáng)療效和降低不良反應(yīng)具有重要意義[6]。目前分析血液中INH、RFP和PZA的研究大部分是含量分析[7~10]，不能反映血漿藥物濃度，且多數(shù)方法只能同時(shí)分析一種或兩種藥物。2014年6月~2015年2月，我們建立了一種聯(lián)合測定血漿INH、AcINH、RFP、PZA濃度的高效液相色譜法(HPLC)，并驗(yàn)證其在肺結(jié)核中的應(yīng)用效果。

1材料

LC-20AB HPLC系統(tǒng)(檢測器為SPD-M20A，島津公司，日本)。INH對照品(批號：100578-200401，中國藥品生物制品檢定所)；AcINH對照品(批號：3-JES-102-4，Toronto Research Chemicals Inc)；PZA對照品(批號：100178-200403，中國藥品生物制品檢定所)；RFP對照品(批號：130496-200702)。乙腈(Merck公司，德國)，為色譜純；磷酸二氫鉀(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國)，三乙胺(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國)，均為分析純。病毒滅活冰凍空白血漿，南京紅十字血液中心。

2同時(shí)檢測血漿INH、AcINH、PZA、RFP的HPLC的建立

2.1色譜條件色譜柱：Waters Xselect-HSS T3(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相：乙腈(A)，0.05 mol/L磷酸二氫鉀(B)(pH 6)，梯度為A∶B=2∶98，1~7 min；7~9 min內(nèi)變化為A∶B=65∶35，9~20 min；20~22 min內(nèi)變化為A∶B=2∶98。淋洗時(shí)間27 min；柱溫40 ℃；流速：1~7 min為0.8 mL/min，7~9 min為1 mL/min，9~20 min為1 mL/min，20~22 min為0.8 mL/min。進(jìn)樣體積20 μL；檢測波長INH和AcINH為 261 nm，PZA 為268 nm，RFP 為340 nm。

2.2血漿樣品處理取空白血漿樣品300 μL放入2 mL離心管中，加乙腈700 μL，旋渦混合5 min，16 000 r/min離心15 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后轉(zhuǎn)移至自動進(jìn)樣器小瓶。

2.3方法專屬性試驗(yàn)按照上述方法，INH、AcINH、RFP、PZA各組分有較好的分離，互不干擾，血漿中的雜質(zhì)峰對樣品的測定亦無影響。

2.4線性關(guān)系考察精密稱取INH、AcINH、RFP、PZA對照品置于10 mL容量瓶中，加入乙腈溶解后稀釋至刻度，配制成濃度均為1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。取2 mL離心管，每只加入不同量含INH、AcINH、RFP、PZA的標(biāo)準(zhǔn)儲備液及300 μL空白血漿，使血漿藥物濃度為0.15、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6、19.2、38.4 μg/mL。參照2.2操作，記錄色譜圖，以濃度(C)為橫坐標(biāo)，樣品峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo)作線性回歸。結(jié)果顯示各組分在0.15~38.4 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，見表1。

表1　HPLC的回歸方程和線性范圍

2.5精密度(RSD)試驗(yàn)分別于300 μL的空白血漿中加入各標(biāo)準(zhǔn)儲備液，精確配制成含低、中、高3種不同濃度(0.5、5、25 μg/mL)的INH、AcINH、RFP、PZA血漿樣品，按2.2操作，測定日內(nèi)(連測5次，取均值)和日間(連測5天，取均值)RSD，結(jié)果顯示RSD均小于10%。見表2。

表2　HPLC日間、日內(nèi)RSD試驗(yàn)結(jié)果

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)于300 μL空白血漿中加入各標(biāo)準(zhǔn)儲備液，精確配制成含低、中、高3種不同濃度(0.5、5、25 μg/mL)的INH、AcINH、RFP、PZA的血漿樣品，分別室溫放置0、2、4、8、12 h后按2.2操作，測定峰面積。結(jié)果顯示測定結(jié)果在不同時(shí)間點(diǎn)基本保持穩(wěn)定，見表3。

2.7回收率試驗(yàn)分別于300 μL空白血漿中加入各標(biāo)準(zhǔn)儲備液，精確配制成含低、中、高濃度(0.5、5、25 μg/mL)的INH、AcINH、RFP、PZA的血漿樣品，按2.2操作，每個濃度測5遍，計(jì)算平均回收率和RSD。通過表4可知四種組分不同濃度回收率的RSD均小于10%。

表3　HPLC的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表4　HPLC的回收率試驗(yàn)結(jié)果(%)

3HPLC驗(yàn)證血藥濃度

選擇肺結(jié)核患者10例，男7例、女3例，年齡25~60歲。均采用標(biāo)準(zhǔn)初治方案(2HREZ/4HR方案)治療。具體方法：INH 0.3 g，1次/天；RFP 0.45 g，1次/天；乙胺丁醇0.75 g，1次/天；PZA 0.5 g，2次/天。患者服藥5天采集血樣，采用上述建立的HPLC同時(shí)測定INH、AcINH、RFP、PZA的血藥濃度。3 h內(nèi)分析完畢。結(jié)果顯示，INH血藥濃度為0.40~5.90(1.80±0.54)μg/mL，AcINH為0.31~3.10(1.61±0.64)μg/mL，RFP為5.50~12.80(7.78±3.06)μg/mL，PZA為2.98~17.37 μg/mL(7.12±3.21 μg/mL)。除1例AcINH和1例RFP血藥濃度低于線性范圍外，其余數(shù)據(jù)均在線性范圍內(nèi)。

4討論

INH、RFP、PZA、乙胺丁醇是結(jié)核病初始治療中最重要的幾種藥物，由于乙胺丁醇分子中缺乏共軛結(jié)構(gòu)，沒有紫外吸收，因此不能被紫外檢測到。本研究中HPLC使用的是紫外檢測器，所以不能觀察乙胺丁醇的血藥濃度。由于INH、AcINH、RFP、PZA的極性相差較大，分析此類物質(zhì)一般會使用敏感性較高的液相-質(zhì)譜法聯(lián)用(LC-MS)，鮮有采用HPLC分析血漿中這幾種藥物濃度的報(bào)道，且在為數(shù)不多的采用HPLC進(jìn)行分析的幾篇報(bào)道中均使用離子對試劑[11,12]。本課題組經(jīng)過試驗(yàn)后認(rèn)為離子對試劑存在柱平衡時(shí)間長、重現(xiàn)性差、對色譜柱損害大和成本高等缺點(diǎn)，不宜作為一種常規(guī)檢測方法用于血藥濃度檢測。本課題組之前使用磷酸緩沖鹽和甲醇建立了分析血漿INH、AcINH和PZA的方法[12～15]。由于RFP極性較小，我們首先在原有方法學(xué)中增加梯度洗脫的程序。在分析完INH、AcINH和PZA后逐步提高甲醇比例至90%。此方法雖然可以分析血藥濃度，但存在以下不足：①甲醇洗脫能力相對較弱，導(dǎo)致RFP出峰時(shí)間過晚，整個分析時(shí)間超過45 min；②需調(diào)整甲醇比例至90%，如此高的有機(jī)相比例有可能引起緩沖鹽析出，堵塞色譜系統(tǒng)；③由于洗脫梯度較陡，在后面的色譜圖中出現(xiàn)了較為明顯的溶劑峰，增加了分辨主峰的難度。將甲醇換為洗脫能力較強(qiáng)的乙腈后發(fā)現(xiàn)，雖然只需要65%的有機(jī)相就可以使RFP在十幾分鐘出峰，但是AcINH和INH的分離度降低，使得這兩種組分無法分離。本研究通過增加色譜柱的長度，成功解決了上述組分無法分離的問題。使用250 mm的C18柱，在乙腈和磷酸鹽的體系中可以很好地實(shí)現(xiàn)各組分的分離和分析。此外，為了避免溶劑峰影響RFP的分析，可以在340 nm波長對其進(jìn)行檢測。340 nm是RFP的特征吸收波長，對其他物質(zhì)和溶劑幾乎不會產(chǎn)生干擾。

本研究發(fā)現(xiàn)，采用2HREZ/4HR方案治療的肺結(jié)核患者即使樣本中各藥物含量低，采用本研究所建立的HPLC在0.15~38.4 μg/mL的線性范圍也能準(zhǔn)確被測定，并且檢測時(shí)間符合臨床檢測的需要。借助于血藥濃度監(jiān)測，可以發(fā)現(xiàn)個體差異導(dǎo)致血藥濃度偏離正常值的情況，從而為實(shí)現(xiàn)結(jié)核病患者個體化治療打下基礎(chǔ)。本試驗(yàn)簡單、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)，敏感性并不不低于LC-MS，方法回收率高于80%，日間和日內(nèi)RSD小于10%，符合生物樣品分析要求。10例肺結(jié)核患者的INH、AcINH、RFP、PZA血藥濃度檢測結(jié)果顯示，除1例AcINH和1例RFP血藥濃度低于線性范圍外，其余數(shù)據(jù)均在線性范圍內(nèi)。說明本研究建立的HPLC可用于臨床藥物檢測及藥物動力學(xué)研究。

總之，本研究成功建立了同時(shí)檢測血漿INH、AcINH、RFP、PZA的HPLC，該法專屬性好，樣品處理簡單，符合生物樣品分析要求，可用于臨床常規(guī)開展抗結(jié)核藥的血藥濃度檢測。

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Establishment and application of HPLC in determining INH, AcINH, RFP

and PZA simultaneously in plasma of patients with tuberculosis

ZHANGLiang,QIANZhi-lei,LULei,HOUWen-jie,DINGHong-zi,WANGJie

(NanjingChestHospital,Nanjing210029,China)

Abstract:ObjectiveTo establish the high-performance liquid chromatography (HPLC) in order to determine the concentration of isoniazid (INH), rifampicin (RFP), pyrazinamide (PZA) and acetylisoniazid (AcINH) simultaneously in the plasma of patients with tuberculosis, and to verify its effect. MethodsThe HPLC method was carried out on a Waters Xselect-HSS T3 (250 mm×4.6 mm, 5 μm) column with 0.05 mol/L KH2PO4(adjusting PH to 5.6 with triethylamine)-acetonitrile as mobile phase. The column temperature was 40 ℃, the flow rate was 0.8-1.0 mL/min, and the inject volume was 20 μL. Meanwhile, the plasma containing reference substances of INH, RFP, PZA and AcINH were injected. Then we tested the specificity, linear relationship, precision, accuracy, stabilization and extraction recovery. We detected the concentrations of INH, AcINH, RFP and PZA in the plasma of 10 tuberculosis patients who took INH, RFP and PZA as treatment program by HPLC method. ResultsThis method had a good separation effect on INH, AcINH, RFP, and PZA without interference of each other, and all calibration curves had good linearity (r2>0.99) within the test ranges. The intra- and inter-day precision was less than 10%, the extraction recovery was between 80%-120%. Except 1 case of AcINH and 1 case of RFP below the linear range, during the 10 tuberculosis patients, the rest were within the linear range. ConclusionsHPLC that can determine the concentrations of INH, PZA, RFP and AcINH simultaneously in plasma of tuberculosis patients is successfully established. The method is sensitive, simple and rapid. It is suitable for analytical require of biological samples.

Key words:tuberculosis; high-performance liquid chromatography (HPLC); isoniazid; rifampicin; pyrazinamide; acetylisoniazid; blood drug concentration

收稿日期：(2014-05-08)

中圖分類號：R52

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)48-0023-04

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.48.007

通信作者簡介：王潔(1965-)，女，主任藥師，研究方向?yàn)榕R床藥學(xué)。E-mail: 13905165431@163.com

作者簡介：第一張亮(1984-)，男，藥師，研究方向?yàn)轶w內(nèi)藥物分析及個體化給藥。E-mail: zhshine310@163.com

基金項(xiàng)目：南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展重點(diǎn)項(xiàng)目(zkx13041)。