王慕，徐麗,周志鋼，董肇楊，唐雪鴻，曾勇，朱麗倩(武警上海市總隊(duì)醫(yī)院，上海201103)

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γ射線照射對(duì)小鼠皮膚缺損創(chuàng)面愈合的影響及其機(jī)制探討

王慕，徐麗,周志鋼，董肇楊，唐雪鴻，曾勇，朱麗倩(武警上海市總隊(duì)醫(yī)院，上海201103)

摘要：目的觀察γ射線照射對(duì)小鼠皮膚缺損創(chuàng)面愈合的影響，并探討其可能的機(jī)制。方法將60只健康雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組，各30只。觀察組采用60Co-γ射線(6 Gy)照射小鼠全身5 min，照射后腹腔麻醉消毒，于小鼠背部造成深及筋膜的1 cm×1 cm大小皮膚缺損創(chuàng)面，用TegadermTM貼膜覆蓋創(chuàng)面后隔日換藥。對(duì)照組不予射線照射，其余處理同觀察組。兩組于造模后第3天(T0)、7天(T1)、14天(T2)，采用Image Proplusv1.5圖像分析系統(tǒng)測(cè)量殘余創(chuàng)面面積，記錄創(chuàng)面組織新生毛細(xì)血管及成纖維細(xì)胞數(shù)量，采用Real-time PCR法檢測(cè)創(chuàng)面組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、堿性成纖維因子2(FGF-2)、血小板衍生因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)mRNA相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組殘余創(chuàng)面面積逐漸減小，創(chuàng)面新生毛細(xì)血管及成纖維細(xì)胞數(shù)量均先升高后降低。觀察組各時(shí)點(diǎn)殘余創(chuàng)面面積均超過(guò)對(duì)照組，T0時(shí)點(diǎn)新生毛細(xì)血管數(shù)量和T0、T1時(shí)點(diǎn)成纖維細(xì)胞數(shù)量均低于對(duì)照組，P均<0.05。觀察組T0、T1時(shí)點(diǎn)VEGF、PDGF、TGF-β和各時(shí)點(diǎn)FGF-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組，P均<0.05。結(jié)論γ射線照射可以導(dǎo)致小鼠皮膚缺損創(chuàng)面愈合延遲，可能與其降低血管生成因子和成纖維因子表達(dá)，從而抑制新生血管和肉芽組織形成有關(guān)。

關(guān)鍵詞：放射損傷；γ射線；皮膚缺損；創(chuàng)面愈合；促血管生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β；小鼠

臨床放射治療、核事故及核爆炸等均可造成慢性放射性創(chuàng)面損傷，使局部創(chuàng)面細(xì)胞生存環(huán)境發(fā)生巨大變化，特別是當(dāng)此類患者同時(shí)合并深層組織損傷時(shí)，傷口愈合極其困難[1]。研究發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)血管再生的細(xì)胞分子如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、堿性成纖維因子2(FGF-2)、血小板衍生因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)，在組織修復(fù)、創(chuàng)面愈合的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2，3]。但是，放射性損傷組織愈合困難是否與上述生長(zhǎng)因子的表達(dá)異常有關(guān)鮮見(jiàn)報(bào)道。2012年3月～2013年10月，我們觀察了γ射線照射對(duì)小鼠皮膚缺損創(chuàng)面愈合的影響，并對(duì)創(chuàng)面組織中的相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)，為探討其影響創(chuàng)面愈合的機(jī)制提供新思路。

1材料與方法

1.1材料健康雄性C57BL/6小鼠60只(上海第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，3～4 周齡，體質(zhì)量(20±2)g。1%戊巴比妥鈉，北京冬哥科技有限公司；60Co-γ射線，上海第二軍醫(yī)大學(xué)放射醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室；4%多聚甲醛溶液、石蠟，上海振普生物科技有限公司；液氮，上海加杰特種氣體有限公司；紫外分光光度儀，上海元析儀器有限公司；SYBR PT-PCR試劑盒，美國(guó)RD公司。

1.2造模與分組將60只健康雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組，各30只。觀察組采用60Co-γ射線(6 Gy)照射小鼠全身5 min，照射后采用1%戊巴比妥鈉按40 mg/kg體質(zhì)量進(jìn)行腹腔麻醉，平板固定小鼠四肢，75%乙醇消毒小鼠背部，在其背部造成深及筋膜的皮膚缺損創(chuàng)面(1 cm×1 cm)；采用TegadermTM貼膜覆蓋創(chuàng)面，傷后隔日換藥，獨(dú)籠飼養(yǎng)。對(duì)照組不予射線照射，其余處理同觀察組。

1.3相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1殘余創(chuàng)面面積兩組于造模后第3天(T0)、7天(T1)及14天(T2)，在TegadermTM貼膜上沿小鼠背部創(chuàng)傷創(chuàng)緣劃線，采用Image Proplusv1.5圖像分析系統(tǒng)測(cè)量殘余創(chuàng)面面積。

1.3.2創(chuàng)面組織新生毛細(xì)血管及成纖維細(xì)胞數(shù)量?jī)山M于各時(shí)點(diǎn)測(cè)量殘余創(chuàng)面面積后分別注射過(guò)量麻醉藥物處死小鼠10只，取創(chuàng)面組織(包括傷口周圍部分正常皮膚和創(chuàng)面下方的薄層肌肉組織)。部分創(chuàng)面組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，組織切片后行HE染色。于高倍(×4 000)顯微鏡下觀察，每張切片上下左右分別隨機(jī)選取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)視野內(nèi)的新生毛細(xì)血管和成纖維細(xì)胞，取平均值。其余組織保存于液氮中備用。

1.3.3創(chuàng)面組織VEGF、FGF-2、PDGF、TGF-β mRNA相對(duì)表達(dá)量采用Real-time PCR法。取保存于液氮中的創(chuàng)面組織，按TRIzol試劑盒說(shuō)明步驟提取總RNA，紫外分光光度儀檢測(cè)A260/A280值, 計(jì)算RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，利用SYBR PT-PCR試劑盒及實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)檢測(cè)組織VEGF、FGF-2、PDGF、TGF-β mRNA相對(duì)表達(dá)量。各引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系10 μL：10×buffer 2 μL、混合引物2 μL，cDNA模板1 μL、SYBR Green 0.4 μL、dNTP 2 μL、Tap酶0.4 μL ,余用雙蒸水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min，95 ℃ 變性30 s，58 ℃退火30 s，在72 ℃下延伸10 s；其中VEGF進(jìn)行26個(gè)循環(huán)，TGF-β進(jìn)行28個(gè)循環(huán)，PDGF進(jìn)行32個(gè)循環(huán)，F(xiàn)GF-2進(jìn)行32個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。檢測(cè)均進(jìn)行3次，取平均值。mRNA相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt表示。

表1　VEGF、FGF-2、PDGF、TGF-β及GAPDH引物序列

2結(jié)果

2.1兩組各時(shí)點(diǎn)殘余創(chuàng)面面積、新生毛細(xì)血管及成纖維細(xì)胞數(shù)量比較隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組殘余創(chuàng)面面積逐漸減小。觀察組各時(shí)點(diǎn)殘余創(chuàng)面面積均超過(guò)對(duì)照組，T0時(shí)點(diǎn)新生毛細(xì)血管數(shù)量和T0、T1時(shí)點(diǎn)成纖維細(xì)胞數(shù)量均低于對(duì)照組，P均<0.05。見(jiàn)表2。

2.2兩組各時(shí)點(diǎn)創(chuàng)面組織各因子mRNA表達(dá)比較觀察組T0、T1時(shí)點(diǎn)VEGF、PDGF、TGF-β和各時(shí)點(diǎn)FGF-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組，P均<0.05。見(jiàn)表3。

表2　兩組各時(shí)點(diǎn)殘余創(chuàng)面面積、新生毛細(xì)血管

注：與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05。

表3　兩組各時(shí)點(diǎn)創(chuàng)面組織各因子mRNA

注：與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05。

3討論

創(chuàng)傷愈合的修復(fù)過(guò)程中一般會(huì)先發(fā)生局部炎癥反應(yīng)，繼而形成肉芽組織并不斷增生，隨后新生組織不斷地再生、重建修復(fù)。其中，肉芽組織的形成是創(chuàng)傷愈合的關(guān)鍵，而新生毛細(xì)血管形成以及成纖維細(xì)胞增殖是形成肉芽組織、促進(jìn)缺損傷口愈合的主要因素。γ射線波長(zhǎng)較短、電離密度較低、穿透力較強(qiáng)，易透過(guò)皮膚達(dá)深層組織，故在放療及輻射性損傷中多引起皮膚及深層軟組織的損傷；同時(shí)也可以對(duì)機(jī)體的胃腸系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷。本研究中γ射線照射的觀察組各時(shí)點(diǎn)殘余創(chuàng)面面積均明顯超過(guò)對(duì)照組，也證明了皮膚放射性損傷修復(fù)困難。其機(jī)制相對(duì)復(fù)雜，可能與新生血管及造血細(xì)胞的形成、成纖維細(xì)胞等修復(fù)細(xì)胞功能的改變、間質(zhì)膠原合成降低等諸多因素有關(guān)[4]。本研究中無(wú)論是單純創(chuàng)傷還是放射性損傷，在創(chuàng)傷的修復(fù)過(guò)程中均存在新生毛細(xì)血管數(shù)量及成纖維細(xì)胞數(shù)量先升高后降低的發(fā)展趨勢(shì)，觀察組基本上低于對(duì)照組。分析原因，可能是創(chuàng)傷早期主要以炎性反應(yīng)為主，刺激了血管內(nèi)皮細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞的增生，并使之達(dá)到一個(gè)相對(duì)較高的峰值，而后期隨著炎性反應(yīng)的減弱，新生的毛細(xì)血管及成纖維細(xì)胞的增殖速度也會(huì)逐漸降低。對(duì)于放射性損傷而言，創(chuàng)面在放射性物質(zhì)的作用下，愈合過(guò)程相對(duì)滯后，因此新生毛細(xì)血管及成纖維細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較少。

皮膚放射性損傷缺損創(chuàng)面在愈合過(guò)程中，機(jī)體分泌的影響新生血管形成的生長(zhǎng)因子發(fā)生變化，進(jìn)而影響創(chuàng)傷的愈合速度。因此，新生血管形成障礙是導(dǎo)致愈合延遲的主要因素之一[5，6]。VEGF、FGF-2、PDGF等促血管生長(zhǎng)因子在新生血管形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7～9]。VEGF通過(guò)刺激和作用于細(xì)胞表面的受體(VEGFR-1、-2、-3)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，這些受體屬于酪氨酸激酶家族中的血小板源性生長(zhǎng)因子受體。VEGF可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性分裂增殖，提高新生血管的生成速度；同時(shí)使血管通透性增加，血管內(nèi)成分滲漏，作為基質(zhì)使血管內(nèi)皮遷移，形成新的毛細(xì)血管[10]。FGF-2做為FGF家族中的主要成員，是目前已知的最強(qiáng)的促細(xì)胞生成因子，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并使血管的通透性增加，在創(chuàng)傷愈合及損傷組織修復(fù)過(guò)程中的新生血管生成階段發(fā)揮至關(guān)重要的作用。血管的形成過(guò)程主要包括小動(dòng)脈和毛細(xì)血管的形成，其中VEGF在毛細(xì)血管形成中發(fā)揮促進(jìn)作用，而FGF-2則主要促進(jìn)小動(dòng)脈的形成[11]。研究表明，VEGF和FGF-2在微血管內(nèi)皮細(xì)胞形成過(guò)程中相互作用，F(xiàn)GF-2使VEGF的表達(dá)升高，同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生的VEGF促使FGF-2誘導(dǎo)血管生成，并可提高內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力[12，13]。PDGF也是一類由血小板及巨噬細(xì)胞分泌的重要生長(zhǎng)因子，在創(chuàng)傷的愈合過(guò)程中，創(chuàng)面成纖維細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞在滲出液中PDGF的作用下不斷增殖，進(jìn)而促進(jìn)肉芽組織生成[14]。同時(shí)也使參與創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中的各種炎癥細(xì)胞趨化至創(chuàng)面，使周圍的細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞滲透至毛細(xì)血管內(nèi)，提高新生血管的完整性；并可使成纖維細(xì)胞不斷增殖，激發(fā)形成細(xì)胞外基質(zhì)[15]。上述促血管生成因子多參與創(chuàng)傷愈合早期的炎性反應(yīng)，并使微血管的滲透性發(fā)生改變，更有利于外周細(xì)胞進(jìn)入到毛細(xì)血管中，加快周圍基質(zhì)的形成。本研究中觀察組創(chuàng)傷第3、7天VEGF、PDGF及創(chuàng)傷后各時(shí)點(diǎn)FGF-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組，其原因可能是射線導(dǎo)致缺損創(chuàng)面分泌上述因子的巨噬細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，繼而引起促進(jìn)血管生成因子表達(dá)降低，最終導(dǎo)致傷口愈合延遲。

纖維組織的形成也是促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的主要因素，射線會(huì)導(dǎo)致缺損創(chuàng)面成纖維細(xì)胞數(shù)量及功能發(fā)生變化，從而導(dǎo)致創(chuàng)傷愈合延遲。TGF-β可以引起成纖維細(xì)胞趨化，參與細(xì)胞外基質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成，促進(jìn)形成肉芽組織[16，17]。本研究中對(duì)照組TGF-β在創(chuàng)傷第7天達(dá)到峰值，可能與此時(shí)炎癥反應(yīng)減弱而肉芽組織增生增強(qiáng)有關(guān)；而觀察組TGF-β表達(dá)先降低后升高，且表達(dá)明顯低于對(duì)照組，提示放射性損傷愈合過(guò)程中TGF-β表達(dá)變化相對(duì)滯后，同時(shí)肉芽組織形成緩慢，導(dǎo)致創(chuàng)口延遲愈合。

綜上所述，射線可以導(dǎo)致小鼠皮膚缺損創(chuàng)面愈合延遲，可能與其降低促血管生長(zhǎng)因子(VEGF、FGF-2、PDGF)的表達(dá)而造成新生血管數(shù)量減少，降低TGF-β表達(dá)而抑制肉芽組織形成有關(guān)。如針對(duì)上述細(xì)胞因子表達(dá)變化給予糾正及治療，有望為臨床放射性損傷的治療提供新思路。

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Effect of γ-ray on wound healing of skin defect in mice and its mechanism

WANGMu,XULi,ZHOUZhi-gang,DONGZhao-yang,TANGXue-hong,ZENGYong,ZHULi-qian

(ArmedPoliceHospitalofShanghai，Shanghai201103，China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effect of γ-ray on wound healing of skin defect in mice and to explore its mechanism. MethodsA total of 60 healthy male C57BL/6 mice were randomly divided into the control group (n=30) and observation group (n=30). Those C57BL/6 mice in the observation group were irradiated 5 minutes with a single dose of60Co-γ-ray (6 Gy). After the mice were anesthetized and sterilized, 1 cm×1 cm wound to fascia on the back was made, the wound was covered by the TegadermTM paster, and we cleaned the wound every other day. Those mice in the control group were not irradiated, and the other treatments were the same as that in the observation group. The wound residual area was measured using Image analysis system (Image Proplusv 1.5) in the two groups on day 3 (T0), 7 (T1) and 14 (T2) after damage, and the number of new capillaries and fibroblasts in wound were observed at the same time. The mRNA expression levels of vascular endothelial growth factor (VEGF), basic fibroblast growth factor-2 (FGF-2), platelet-derived growth factor (PDGF) and transforming growth factor-β (TGF-β) in the dermal defects were detected by Real-time PCR. ResultsWith the extension of time, the residual wound areas gradually reduced in the two groups, and the newborn capillaries and fibroblasts in wound first increased and then decreased. The residual wound areas were larger in the observation group than those of the control group at different time points. The number of new capillaries at T0, and the number of fibroblasts at T0and T1in observation group were lower than those of the control group at the same time points (all P<0.05). The mRNA expression levels of VEGF, PDGF and TGF-β at T0and T1and the FGF-2 mRNA expression level at each time point in the observation group were lower than those of the control group at the same time points (all P<0.05). ConclusionThe γ-ray can delay the wound healing of skin defect in mice, and it may be related with the decreased expression of angiogenesis factor and fibroblast factor and inhibition of the angiogenesis and granulation tissue formation.

Key words:radiation injury; γ-ray; skin defect; wound healing; angiogenic growth factors; transforming growth factor-β; mice

收稿日期：(2015-09-11)

中圖分類號(hào)：R818

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2015)48-0015-04

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.48.005

作者簡(jiǎn)介：第一王慕(1976-)，女，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)檎?、?chuàng)傷修復(fù)。E-mail: 308375881@qq.com

基金項(xiàng)目：上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研課題(20114341)。