李 迎 張吉林 宋玉國

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，吉林 132011)

特應(yīng)性皮炎(Atopic dermatitis，AD)又稱遺傳過敏性皮炎，是一種與遺傳過敏有關(guān)的慢性炎癥性皮膚病，其發(fā)病主要機制之一是機體免疫調(diào)節(jié)紊亂[1]。多數(shù)患者臨床指標表現(xiàn)為血清IgE水平升高，或同時伴有輔助性T細胞(Th2)升高。Th2細胞是CD4+T細胞中的一個亞群，在清除細胞外病原體、輔助B細胞產(chǎn)生抗體以及機體產(chǎn)生過敏反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。近年來發(fā)現(xiàn)一些微小RNA(mircoRNAs，miRNA)與免疫應(yīng)答密切相關(guān)，其中mircoRNA-155(miR-155)是參與免疫應(yīng)答最重要的miRNA之一，在固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答及炎癥性疾病中均發(fā)揮重要作用[2-5]。

本文應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)和流式細胞技術(shù)分別檢測特應(yīng)性皮炎患者外周血miR-155和T淋巴細胞亞群，并與對照組的檢測結(jié)果進行比較分析，其宗旨是探討特應(yīng)性皮炎患者外周血miR-155和CD4+T細胞檢測的臨床意義。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取2014年1月～2015年4月就診于北華大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科的70例患者。其中特應(yīng)性皮炎患者40例，男16例，女24例，年齡(37.80±9.67)歲；皮膚濕疹患者30例，男13例，女17例，年齡(41.20±15.37)歲。健康對照組30例選自北華大學(xué)附屬醫(yī)院體檢中心。其中男15例，女15例，年齡(36.47±9.87)歲，近期均無皮膚病及過敏性疾病。

1.2標本采集 清晨空腹采集靜脈抗凝(EDTA-K2)血2 ml。其中，1 ml全血用于流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群；另外1 ml全血分離血漿，用于檢測miR-155。

1.3主要儀器和試劑 流式細胞儀，美國Beckman Coulter公司；熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司。熒光抗體(CD3-PC5、CD4-FITC和CD8-PE)，美國Beckman Coulter公司；miRcute miRNA提取試劑盒、miRNA 3′末端加Ploy(A)尾試劑盒、cDNA合成試劑盒和實時熒光定量PCR檢測miR-155試劑盒，均為天根生化科技(北京)有限公司。

1.4外周血T淋巴細胞亞群檢測 采用三色流式細胞術(shù)檢測T淋巴細胞亞群。在試管中加入三種熒光抗體CD3-PC5、CD4-FITC和CD8-PE各20 μl，加入被測抗凝血100 μl，混合均勻，室溫避光標記15 min。溶解紅細胞后用PBS緩沖液4 ml洗滌白細胞一次，混勻，離心1 000 r/min，5 min，小心棄去上清。再加入PBS緩沖液0.5 ml，混勻，應(yīng)用流式細胞儀進行檢測。

1.5血漿miR-155檢測

1.5.1血漿miRNA提取及miRNA 3＇末端加Ploy(A)尾 利用miRNA提取試劑盒提取血漿中miRNA，按試劑盒說明書操作，之后在miRNA 3′末端加Ploy(A)尾。反應(yīng)體系為miRNA 5.0 μl；E.coli Poly(A) Polymerase(5 U/μl) 0.4 μl；10×Poly(A) Polymerase Buffer 2.0 μl；5×rATP Solution 4.0 μl；RNase-Free ddH2O 8.6 μl；總體積20.0 μl。上述反應(yīng)液輕輕混勻，12 000 r/min離心30 s，37℃反應(yīng)60 min。

1.5.2合成cDNA cDNA合成體系為Poly(A) 反應(yīng)液2.0 μl；10×RT Primer 2.0 μl；10×RT Buffer 2.0 μl；Super Pure dNTPs(2.5 mmol/L each)1.0 μl；RNasin(40 U/μl)1.0 μl；Quant RTase 0.5 μl；RNase-Free ddH2O 11.5 μl；總體積20 μl。上述輕輕混勻，12 000 r/min離心，30 s，37℃反應(yīng)60 min。

1.5.3實時熒光定量PCR 采用實時熒光定量PCR檢測miR-155，反應(yīng)體系為2×miRNA Premix 10.0 μl；mir-155-5p Primer 0.4 μl；Reverse Primer 0.4 μl；cDNA 2.0 μl；ddH2O 7.2 μl；總體積20.0 μl。PCR循環(huán)參數(shù)：94℃ 2 min；94℃ 30 s，60℃ 34 s，共45個循環(huán)；熒光采集點設(shè)在60℃ 34 s末。PCR結(jié)束后，以0.05℃/s的速度開始升溫，直至升高到94℃，做熔解曲線分析。計算結(jié)果應(yīng)用Ct值進行相對定量分析，以U6作為內(nèi)參照，計算標本中miR-155的相對表達量。標本中的miRNA相對表達量的計算公式：RQ=2-△Ct，其中△Ct=CtmiR-155-CtU6。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，各組間的比較采用兩樣本t檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1特應(yīng)性皮炎患者外周血T淋巴細胞亞群檢測結(jié)果 流式細胞儀檢測結(jié)果見圖1，所有患者數(shù)據(jù)匯總并經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析得出：特應(yīng)性皮炎組CD4+T細胞百分數(shù)升高，與對照組和濕疹組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.009及0.012)，而特應(yīng)性皮炎組和濕疹組的CD3+T細胞百分率和CD8+T細胞的百分率分別與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果見表1。

2.2特應(yīng)性皮炎患者血漿中miR-155相對表達量檢測結(jié)果 miR-155 PCR產(chǎn)物熔解曲線如圖2A所示，熔解曲線圖僅有單一峰，而未出現(xiàn)多峰，表明目的基因經(jīng)PCR擴增后為單一產(chǎn)物，未出現(xiàn)非特異性擴增，實驗結(jié)果可信。圖2B為miR-155的擴增曲線圖。曲線分為：熒光背景信號階段、指數(shù)擴增階段和平臺期。曲線為平滑的S型，表明操作準確，結(jié)果可信。數(shù)據(jù)分析表明：特應(yīng)性皮炎組患者外周血miR-155相對表達量顯著增加，與濕疹組和對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見表2。

表1 各組患者外周血T淋巴細胞亞群檢測結(jié)果

Note：Compared with control group,1)P<0.01; Compared with skin eczema group,2)P<0.05.

圖1 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果圖Fig.1 Flow cytometry test resultsNote: A.Peripheral blood mononuclear cells scatter plot; B.CD4+ T cells in the test results; C.CD8+ T cells in the test results.

圖2 miR-155 PCR產(chǎn)物熔解曲線及PCR擴增曲線Fig.2 miR-155 PCR product melting and amplifica-tion curve

表2 各組患者血漿中miR-155相對表達量檢測結(jié)果

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with skin eczema group,2)P<0.05.

3 討論

特應(yīng)性皮炎的發(fā)病機制十分復(fù)雜，可能與遺傳、免疫、環(huán)境等多種因素有關(guān)，其中免疫學(xué)機制是目前的研究熱點。該病的臨床表現(xiàn)多樣，可表現(xiàn)為急性發(fā)作和慢性反復(fù)發(fā)作，在患者的不同年齡階段可呈現(xiàn)不同的臨床表現(xiàn)。本文所選病例均為12歲以上的青年成人期患者，臨床診斷均符合國際通用的Williams診斷標準[1]。現(xiàn)已明確，T淋巴細胞在特應(yīng)性皮炎的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。T淋巴細胞包括CD4+T細胞(輔助性T細胞，Th細胞)和CD8+T細胞(細胞毒性T細胞)。Th細胞又分為Th1細胞、Th2細胞和新近發(fā)現(xiàn)的Th17細胞，其中Th2細胞與過敏性疾病密切相關(guān)。Leung等[6]報道，特異性皮炎的急性期機體會發(fā)生以Th2細胞占優(yōu)勢的免疫應(yīng)答，Th2型細胞因子誘導(dǎo)Th1/Th2細胞亞群失衡并伴有IgE上升和嗜酸性粒細胞增多。另外，也有學(xué)者通過動物實驗研究Th1/Th2細胞亞群在特應(yīng)性皮炎中的關(guān)系。例如，李秀梅等[7]利用小鼠AD動物模型探討了AD治療過程中，某些有效藥物是通過誘導(dǎo)小鼠Th1型細胞因子的產(chǎn)生進而抑制了Th2型細胞免疫反應(yīng)，緩解了AD皮膚炎癥的發(fā)生。本文對急性期特應(yīng)性皮炎患者檢測了外周血T淋巴細胞亞群，結(jié)果發(fā)現(xiàn)特應(yīng)性皮炎組CD4+T細胞百分率明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，此結(jié)果與曾迎紅[8]的報道一致；研究結(jié)果還顯示特應(yīng)性皮炎組CD4+T細胞百分率也高于濕疹患者組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Th2細胞是CD4+T細胞的一個亞群，在急性期特應(yīng)性皮炎患者中CD4+T細胞升高是否與Th2細胞升高有關(guān)，還需要進一步應(yīng)用細胞內(nèi)細胞因子標記法檢測Th1/Th2細胞的變化情況來證實。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)miRNA與過敏性疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)。在眾多miRNA當中，miR-155是免疫系統(tǒng)最主要的miRNA之一，在活化的各種免疫細胞中表達普遍升高，廣泛參與固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。特應(yīng)性皮炎也屬于過敏性皮膚病，是臨床上常見的免疫相關(guān)性疾病，miR-155在特應(yīng)性皮炎的發(fā)生發(fā)展中的作用如何，也是近年的研究熱點。本實驗應(yīng)用實時熒光PCR技術(shù)定量檢測特應(yīng)性皮炎和濕疹患者血漿中miR-155的相對表達量，以健康人作為對照組，結(jié)果表明特應(yīng)性皮炎患者血漿中miR-155的相對表達量高于濕疹患者和對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。本研究結(jié)果與Sonkoly[9]報道相一致，該文研究結(jié)果表明：miR-155在特應(yīng)性皮炎患者中的表達與對照組比較顯著升高。由于miR-155過表達，下調(diào)細胞毒性T細胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)表達，促進Th細胞增殖導(dǎo)致皮膚發(fā)生炎癥改變。因此，特應(yīng)性皮炎患者miR-155表達升高的主要原因是炎癥部位浸潤的CD4+T細胞所致。Pedersen[10]的研究中也表明，在敲除miR-155基因的小鼠體內(nèi)，Th0型淋巴細胞向Th2型分化，細胞因子IL-4、IL-10 分泌增加。而Banerjee[11]報道卻認為，miR-155調(diào)控IFN-γ受體α的靶基因，促使Th0型淋巴細胞向Th1型分化。

綜上，檢測miR-155有助于特應(yīng)性皮炎的臨床診斷，并且在與皮膚濕疹的鑒別方面也有一定的臨床意義。檢測淋巴細胞亞群，特別是CD4+T細胞檢測有助于判斷患者的免疫應(yīng)答狀況。 miR-155與機體細胞免疫應(yīng)答之間存在一定的內(nèi)在聯(lián)系，miR-155在Th細胞的分化以及細胞因子的調(diào)節(jié)中是如何發(fā)揮作用等問題將在后續(xù)的研究中進一步探討。

[1] 張學(xué)軍.皮膚性病學(xué)[M].第8版.北京: 人民衛(wèi)生出版社,2013：111-113.

[2] Cheng SF,Li L,Wang LM.miR-155 and miR-146b negatively regulates IL6 in Helicobacter pylori (cagA+) infected gastroduodenal ulcer[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2015,19(4):607-613.

[3] Singh UP,Murphy AE,Enos RT,etal.miR-155 deficiency protects mice from experimental colitis by reducing T helper type 1/type 17 responses[J].Immunology,2014,143(3):478-489.

[4] Okoye IS,Czieso S,Ktistaki E,etal.Transcriptomics identified a critical role for Th2 cell-intrinsic miR-155 in mediating allergy and antihelminth immunity[J].Proc Natl Acad Sci USA,2014,111(30):E3081-3090.

[5] Escobar TM,Kanellopoulou C,Kugler DG,etal.miR-155 activates cytokine gene expression in Th17 cells by regulating the DNA-binding protein Jarid2 to relieve polycomb-mediated repression[J].Immunity,2014,40(6):865-879.

[6] Leung DY,Bieber T.Atopic dermatitis[J].Lancet,2003,361(9352):151-160.

[7] 李秀梅,王國英,張 文,等.甲殼質(zhì)抗特異性皮炎的實驗研究[J].中國免疫學(xué)雜志,2015,31(3):323-328.

[8] 曾迎紅,湯建萍,葉志純,等.特應(yīng)性皮炎患兒外周血T細胞亞群與總IgE水平的相關(guān)性研究[J].皮膚與性病,2010,32(3):1-2.

[9] Sonkoly E,Janson P,Majuri ML,etal.MiR-155 is overexpressed in patients with atopic dermatitis and modulates T-cell proliferative responses by targeting cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4[J].J Allergy Clin Immunol,2010,126(3):581-589.

[10] Pedersen IM,Otero D,Kao E,etal.Onco-miR-155 targets SHIP1 to promote TNFα-dependent growth of B cell lymphomas[J].EMBO Mol Med,2009,1(5):288-295.

[11] Banerjee A,Schambach F,DeJong CS,etal.Micro-RNA-155 inhibits IFN-gamma signaling in CD4+T cells[J].Eur J Immunol,2010,40(1):225-231.