錢小寶 王 瑜 梅仁彪 張文杰 馬 婕 王曉瑜

(安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，淮南 232001)

原發(fā)性高血壓(Essential hypertension，EH)是體循環(huán)動(dòng)脈壓增高為特征的心血管綜合征。腎臟作為調(diào)節(jié)血壓的重要器官，是高血壓病較早累及的重要器官，腎臟功能的受損會(huì)進(jìn)一步加重高血壓病情。近期資料顯示，T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在高血壓導(dǎo)致的腎損害中發(fā)揮著重要的致病作用［1-5］。

可誘導(dǎo)共刺激分子(Inducible costimulation molecule，ICOS)作為一種重要的共刺激分子，在CD4+T細(xì)胞的增殖和分化中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。多種疾病的動(dòng)物模型研究表明，以ICOS信號(hào)為靶點(diǎn)的免疫調(diào)節(jié)對(duì)包括自身免疫性疾病、移植免疫長(zhǎng)期耐受的形成和血吸蟲性肝纖維化等疾病均有著重要的臨床治療意義［6-8］。那么，ICOS介導(dǎo)的免疫反應(yīng)是否參與高血壓導(dǎo)致的腎損傷機(jī)制?目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。因此，本課題組應(yīng)用高血壓動(dòng)物模型SHR大鼠及同品系的野生型WKY大鼠為研究對(duì)象，動(dòng)態(tài)觀察上述大鼠ICOS表達(dá)水平以及腎損傷情況，初步探究ICOS介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在高血壓導(dǎo)致的腎損傷中的作用，為進(jìn)一步深入了解高血壓的免疫調(diào)控機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA聚合酶(德國(guó)Thermo Scientific公司);Trizol試劑(上海生工生物工程股份有限公司);抗大鼠ICOS單克隆抗體(美國(guó)eBioscience公司);抗大鼠TGF-β1多克隆抗體、抗大鼠 IL-17多克隆抗體(北京 Bioss公司);RM2235型切片機(jī)(德國(guó) Leica公司);Mastercycler?personal型PCR擴(kuò)增儀(德國(guó)Eppendorf公司);高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Beckman公司);Mulitskan Ascent型酶標(biāo)儀(賽默飛世爾公司);ChampGel 5000型凝膠攝像系統(tǒng)(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司);BP-6A型全自動(dòng)無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡SPF級(jí)雄性SHR大鼠、WKY大鼠各32只，購(gòu)自北京維通利華公司(No.11400700026226-8)。按簡(jiǎn)單隨機(jī)法將SHR和WKY大鼠各分為4組，每組8只，分別在4周(0期)、6周(高血壓起始期)、10周(高血壓成型期)、23周(靶器官損害期)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察。每只大鼠按100 g/(kg·d)投飼，自由飲水。

1.2.2 大鼠血壓和體重的測(cè)定 采用BP-6A型全自動(dòng)無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x，在大鼠清醒狀態(tài)下直接測(cè)量大鼠的尾動(dòng)脈收縮壓，同時(shí)用天平稱量大鼠體重。

1.2.3 大鼠尿蛋白檢測(cè) 將大鼠放入潔凈的代謝籠中，正常飲水禁食下留取24 h尿液，測(cè)量24 h尿量，采用酶標(biāo)儀測(cè)定尿蛋白(UP)。

1.2.4 大鼠腎臟中ICOS mRNA的表達(dá) 無(wú)菌取各期大鼠左腎組織50 mg，按照氯仿-異丙醇法提取總RNA，按照 RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒說(shuō)明書合成cDNA第一鏈。采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，以大鼠的GAPDH mRNA為內(nèi)參照。各對(duì)引物序列如下:GAPDH上游引物5'-CCGTATCGGACGCCTGGTT-3'，下 游 引 物 5'-GCGGATCTCGCTCCTGGAAG-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度 212 bp;ICOS上游引物5'-CTCGTGCGTCTTTGTCTTCTGC-3'，下游引物 5'-ACATGTACTCGCTATTAGGGTCGTG-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度303 bp。PCR反應(yīng)體系組成cDNA(1/4稀釋液)2 μl，10 × Buffer 2.5 μl，dNTP mix(10 mmol/L)0.5 μl，上游引物(10 pmol)1 μl，下游引物(10 pmol)1 μl，Mg2+(2.0 mmol/L)2 μl，Taq DNA Polymerase(1 U)1 μl，用滅菌去離子水補(bǔ)足至總反應(yīng)體系25 μl，混勻。各對(duì)引物的PCR循環(huán)參數(shù)為:預(yù)變性94℃4 min，變性94℃ 60 s，退火 54℃ 45 s，延伸72℃ 90 s，共 35個(gè)循環(huán)，終末延伸 72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物凝膠分析結(jié)果應(yīng)用ChampGel 5000型凝膠攝像系統(tǒng)測(cè)量ICOS mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 大鼠腎臟 ICOS、IL-17A、TGF-β1免疫組織化學(xué)法(SP法)染色的觀察 將上述各期大鼠右腎組織用4%中性甲醛溶液充分固定后進(jìn)行常規(guī)脫水、包埋、連續(xù)切片(厚度為3 μm)，應(yīng)用二步法免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)上述切片進(jìn)行染色。陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)為顯現(xiàn)出境界清晰，突出于背景的棕黃色或棕褐色顆粒。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不同視野，用顯微圖像系統(tǒng)攝像。用Image-pro Plus 6.0軟件對(duì)圖像進(jìn)行半定量分析。選取圖片上具有染料色調(diào)的區(qū)域即有效區(qū)域(Area of interesting，AOI)，測(cè)量選擇區(qū)域內(nèi)的累積光密度值(Integrated optical density，IOD)，選擇并測(cè)量有效統(tǒng)計(jì)區(qū)域的面積(Area of valid statistics interest，AOVI)，然后計(jì)算選擇區(qū)域內(nèi)的光密度平均值(IOD/AOVI)，依此計(jì)算同一實(shí)驗(yàn)組切片各個(gè)圖像的光密度平均值的均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.6 大鼠血漿中IL-17A和TGF-β1的檢測(cè) 采集上述同期大鼠血漿，按照ELISA試劑盒說(shuō)明測(cè)定上述各期大鼠血漿中IL-17A和TGF-β1的水平。按照每塊酶標(biāo)板上的標(biāo)準(zhǔn)品的A450值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品中IL-17A和TGF-β1(ng/ml)的含量。

1.2.7 大鼠腎臟組織HE和Masson染色觀察 取上述各時(shí)期大鼠的石蠟切片，分別常規(guī)HE染色觀察腎臟病理改變及按照MASSON試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行染色觀察腎纖維化程度。膠原纖維被染為藍(lán)色，而其他組織細(xì)胞則被染為紅色，觀察膠原沉積情況，選取圖片上藍(lán)色區(qū)域作為有效區(qū)域，依據(jù)前文所述方法計(jì)算同一實(shí)驗(yàn)組切片各個(gè)圖像的光密度平均值的均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差，作為腎纖維化程度指標(biāo)。

1.2.8 ICOS表達(dá)動(dòng)態(tài)變化與腎纖維化評(píng)分動(dòng)態(tài)變化的相關(guān)性分析 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，分析ICOS蛋白表達(dá)水平和mRNA表達(dá)水平在4周齡至23周齡的變化值與腎纖維化評(píng)分變化值之間的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均以±s表示，組間比較應(yīng)用單因素方差分析(oneway，ANOVA)，若方差齊者則采用LSD法比較兩組間差異，數(shù)據(jù)間相關(guān)性采用pearson檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重、血壓和24 h尿蛋白改變 SHR大鼠體重低于WKY大鼠，在6、10、23周兩者差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)。SHR大鼠血壓高于WKY大鼠，在6、10、23周兩者差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)。SHR大鼠24 h尿蛋白值亦高于WKY大鼠，在10、23周兩者差異顯著(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 大鼠基本情況(n=8，±s)Tab.1 Basic situation of SHR and WKY rats(n=8，±s)

表1 大鼠基本情況(n=8，±s)Tab.1 Basic situation of SHR and WKY rats(n=8，±s)

Note:SHR rats vs.WKY rats，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01.

Week Groups Weight(g) SP(mmHg) UP(mg/L)4 SHR 102.2±11.4 121.0±7.3 3.6±1.6 WKY 117.5±22.4 117.2±11.5 3.9±1.5 6 SHR 160.2±5.31)128.8±10.31) 5.9±1.3 WKY 186.8±6.8 109.1±3.8 5.6±1.5 10 SHR 230.6±13.51)152.6±8.61) 8.0±2.01)WKY 252.3±5.5 115.5±11.2 14.1±2.5 23 SHR 310.7±9.12)203.9±13.22) 37.8±2.81)WKY 357.4±7.0 112.9±6.9 17.0±3.2

2.2 大鼠腎臟中ICOS mRNA表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化RT-PCR結(jié)果顯示，SHR大鼠腎臟中ICOS mRNA表達(dá)水平高于同期WKY大鼠，在6周(0.34±0.04 vs.0.22±0.06)、10周(0.59±0.06 vs.0.27±0.05)、23周(0.65±0.1 vs.0.27±0.09)均顯著升高，兩者差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠腎臟中ICOS mRNA的表達(dá)變化(n=8)Fig.1 Expression of ICOS mRNA in rat's kidneys(n=8)

2.3 大鼠腎臟中ICOS、IL-17A、TGF-β1蛋白的表達(dá)SHR大鼠腎臟中ICOS蛋白表達(dá)水平高于同期WKY大鼠，在10周(0.49±0.05 vs.0，20±0.06)、23周(0.55±0.04 vs.0.22±0.09)均顯著升高，兩者差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);SHR大鼠腎臟中IL-17A蛋白的表達(dá)水平亦高于同期WKY大鼠，且在10周(0.44±0.09 vs.0.22±0.08)和23周(0.50±0.07 vs.0.26±0.11)均顯著升高，兩組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);SHR大鼠腎臟中TGF-β1蛋白的表達(dá)水平亦高于同期WKY大鼠，在6周(0.26±0.04 vs.0.14±0.03)、10周(0.34±0.04 vs.0.24±0.06)和23周(0.66±0.10 vs.0.28±0.07)均顯著升高，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖2。

2.4 大鼠血漿IL-17A和TGF-β1水平的動(dòng)態(tài)變化ELISA結(jié)果顯示，SHR大鼠血漿中IL-17A水平高于WKY大鼠，在10周［(115.8±14.5)ng/ml vs.(86.9±12.7)ng/ml］和23周［(142.7±18.6)ng/ml vs.(79.4±24.1)ng/ml］均顯著升高，兩者差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);SHR大鼠血漿中TGF-β1水平亦高于同期WKY大鼠，在10周［(77.3±3.2)ng/ml vs.(62.5±3.8)ng/ml］和 23周［(93.9±6.2)ng/ml vs.(72.3 ±4.9)ng/ml］顯著升高，兩者差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖3。

2.5 腎臟病理的變化 腎臟組織切片HE染色發(fā)現(xiàn)，SHR大鼠腎臟微血管壁明顯增厚、管腔進(jìn)行性狹窄，腎小球體積明顯小于WKY大鼠且出現(xiàn)不同程度的硬化(圖4)。Masson染色結(jié)果顯示，SHR大鼠腎臟組織中小血管、腎小球、腎間質(zhì)均可見(jiàn)纖維化改變。與WKY大鼠相比，SHR大鼠腎臟纖維化水平在10周(0.36±0.05 vs.0.24±0.08)和23周(0.66±0.07 vs.0.29±0.07)顯著升高，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖5。

2.6 ICOS蛋白及其mRNA表達(dá)動(dòng)態(tài)變化與腎纖維化評(píng)分動(dòng)態(tài)變化的相關(guān)性分析 SHR大鼠從4周齡至23周齡ICOS蛋白表達(dá)的變化值分別與腎纖維化評(píng)分的變化值進(jìn)行線性相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，相關(guān)系數(shù)r=0.813，雙側(cè)pearson檢驗(yàn)P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6A)。SHR大鼠從4周齡至23周齡ICOS mRNA表達(dá)的變化值分別與腎纖維化評(píng)分的變化值進(jìn)行線性相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，相關(guān)系數(shù)r=0.753，雙側(cè)pearson檢驗(yàn)P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6B)，可見(jiàn)SHR大鼠ICOS蛋白及其mRNA表達(dá)動(dòng)態(tài)變化與腎纖維化水平有密切的相關(guān)性，且存在顯著正相關(guān)關(guān)系。

圖2 大鼠腎臟中ICOS、IL-17A、TGF-β1的表達(dá)水平Fig.2 Expression of ICOS，IL-17A，TGF-β1 in rat's kidneys

圖3 大鼠血漿TGF-β1和IL-17A表達(dá)水平Fig.3 Expression of TGF-β1 and IL-17A in rat's plasma

圖4 大鼠不同時(shí)期腎臟HE染色(×400)Fig.4 HE staining of rats'kidneys in different stages(×400)

圖5 大鼠不同時(shí)期腎臟Masson染色及纖維化水平(×400)Fig.5 Masson staining and degree of fibrosis of rat's kidneys in different stage(×400)

圖6 SHR大鼠腎臟中ICOS蛋白及其mRNA表達(dá)動(dòng)態(tài)變化與腎纖維化評(píng)分動(dòng)態(tài)變化相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis of dynamic changes of ICOS protein and its mRNA expression and renal fibrosis score in SHR rats

3 討論

近期資料表明，免疫因素也涉及高血壓腎損害的發(fā)?。?0，11］。在高血壓腎損害實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)腎間質(zhì)中有大量的T淋巴細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)［12］。

ICOS是德國(guó)學(xué)者 Hutloff等［13］于1999年在人外周血活化T細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的一種屬于CD28家族的共刺激分子。隨著人們對(duì)ICOS信號(hào)在免疫反應(yīng)中作用認(rèn)識(shí)的逐步深入，發(fā)現(xiàn)ICOS在促進(jìn)活化T細(xì)胞的增生、分化和細(xì)胞因子的產(chǎn)生等方面均發(fā)揮重要的作用［14，15］。本研究發(fā)現(xiàn)SHR大鼠腎臟中ICOS mRNA和蛋白的表達(dá)在6周、10周和23周時(shí)均較WKY大鼠顯著升高，提示SHR大鼠在高血壓發(fā)生發(fā)展過(guò)程中腎臟局部存在ICOS信號(hào)的上調(diào)。另外，通過(guò)對(duì)腎臟病理觀察發(fā)現(xiàn)SHR大鼠在10周和23周時(shí)腎臟纖維化病變顯著，分析SHR大鼠ICOS表達(dá)動(dòng)態(tài)變化與腎纖維化水平相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，二者存在顯著正相關(guān)關(guān)系。表明ICOS可能通過(guò)介導(dǎo)異常的免疫應(yīng)答參與SHR大鼠高血壓發(fā)生發(fā)展和腎纖維化病變。

為進(jìn)一步探究ICOS信號(hào)參與高血壓進(jìn)程中腎纖維化的機(jī)制，本研究同時(shí)檢測(cè)了腎臟和血漿中IL-17A及TGF-β1的表達(dá)水平。IL-17A可以誘導(dǎo)促炎因子、趨化因子的表達(dá)，引起免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和組織炎癥，具有重要的促炎作用。并且在AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓模型中IL-17可促進(jìn)血壓的升高和血管損傷［16］。本研究中也發(fā)現(xiàn)SHR大鼠從6周齡開(kāi)始腎臟中IL-17A表達(dá)顯著高于野生對(duì)照組WKY大鼠同時(shí)伴隨著血壓明顯升高和尿蛋白的輕度升高，提示在原發(fā)性高血壓發(fā)病過(guò)程中有IL-17介導(dǎo)的促炎機(jī)制的參與。TGF-β1被眾多研究證實(shí)是重要的促纖維化因子。在腎臟中，它可以活化固有的間質(zhì)成纖維細(xì)胞，可作用于腎小管上皮細(xì)胞引起細(xì)胞凋亡，促進(jìn)成纖維細(xì)胞—肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化［17］。TGF-β1還可使細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成增多和降解減少，造成ECM在腎間質(zhì)過(guò)度累積，形成腎間質(zhì)纖維化并且損害腎功能［18］。除此之外，TGF-β1能刺激腎臟近球細(xì)胞釋放腎素，使 AngⅡ形成增加導(dǎo)致血壓升高［19］。本研究發(fā)現(xiàn)SHR大鼠腎臟中 TGF-β1蛋白的表達(dá)從6周齡開(kāi)始明顯高于WKY大鼠，并且其TGF-β1表達(dá)增強(qiáng)程度與腎纖維化程度逐漸增加趨勢(shì)一致，提示在原發(fā)性高血壓導(dǎo)致的腎纖維化過(guò)程中可能有TGF-β1的參與。

研究表明，IL-17和 TGF-β1均主要由 Th17細(xì)胞產(chǎn)生。Th17細(xì)胞是一種近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群，在其發(fā)展途徑和功能上獨(dú)立于Th1和Th2細(xì)胞。Th17細(xì)胞作為重要的促炎細(xì)胞在炎癥性疾病和自身免疫性疾病的研究中多見(jiàn)報(bào)道［20，21］。近年來(lái)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在腎臟炎癥性疾病的發(fā)病中也起到了重要作用［22］。值得注意的是，Th17應(yīng)答與ICOS信號(hào)的激活有重要的相關(guān)性［23，24］。Galicia 等［25］研究發(fā)現(xiàn) ICOS 基因敲除小鼠體內(nèi)Th17細(xì)胞減少。Gao等［26］通過(guò)對(duì)IL-10基因敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，絕大部分的Th17細(xì)胞是ICOS+的，且ICOS+Th17細(xì)胞能產(chǎn)生較多的IL-17，且高表達(dá)ICOSL的DCs可以更高效地誘導(dǎo)Th17分化。提示Th17細(xì)胞的分化和細(xì)胞因子的產(chǎn)生需要ICOS信號(hào)的參與。對(duì)其機(jī)制的進(jìn)一步研究表明，在Th17極化環(huán)境下，ICOS信號(hào)能支持臍帶血Th0細(xì)胞向Th17的分化［14］。并且ICOS信號(hào)可以誘導(dǎo)更高水平的NFATc1進(jìn)而促進(jìn)Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-17A［27］。本研究發(fā)現(xiàn)在 SHR大鼠腎臟中 ICOS mRNA和蛋白的表達(dá)均較WKY大鼠顯著升高且與腎臟中IL-17A和TGF-β1表達(dá)的變化趨勢(shì)一致，因此IL-17A和TGF-β1表達(dá)水平的增多可能是通過(guò)ICOS信號(hào)導(dǎo)致的Th17細(xì)胞活化產(chǎn)生的，繼而通過(guò)這兩種細(xì)胞因子促進(jìn)了腎纖維化的病變。相關(guān)的調(diào)控機(jī)制尚有待進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)。

本研究中也發(fā)現(xiàn)，隨著SHR大鼠血壓升高至高血壓成型期水平(10周齡)，其血漿中亦存在IL-17A和TGF-β1表達(dá)的明顯增加，提示IL-17A和TGF-β1表達(dá)的上調(diào)可能參與高血壓疾病進(jìn)展的整體機(jī)制。而ICOS信號(hào)的增強(qiáng)可能促進(jìn)這種失衡進(jìn)一步發(fā)展。

綜上所述，在高血壓導(dǎo)致的腎纖維化中，ICOS介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可能起重要的作用。

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