李姍姍 秦 歡 丁陳波 李龍梅 劉 梅 李娜娜 張繼東 徐 林 羅軍敏

(遵義醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，貴州省生物治療人才基地，遵義 563099)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的慢性傳染性疾病，2012年全球結(jié)核病患者為860萬，其中130萬例死亡(包括32萬例HIV陽性人群)［1］，我國更是繼印度之后的第二大結(jié)核國。當機體感染MTB后，宿主免疫系統(tǒng)與MTB相互斗爭，在此過程中約5%的人群發(fā)病，另外5%人群可能在感染后的某個時刻發(fā)病(如感染者抵抗力下降)，而約90%的感染者可能一生都不發(fā)?。?］。機體的巨噬細胞是免疫清除的主要效應(yīng)細胞，MTB激活巨噬細胞后通過抗原呈遞、免疫殺傷等作用抑制或殺滅MTB，保護機體。在MTB感染早期，巨噬細胞向M1型極化發(fā)揮抗感染的作用;在結(jié)核慢性感染過程中巨噬細胞主要向M2型極化發(fā)揮抗炎癥作用［3，4］。大量研究發(fā)現(xiàn)許多物質(zhì)都可誘導(dǎo)巨噬細胞極化，如單核趨化蛋白-1(Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、PPARα、DnaK 和青藤堿等［5-8］。近年研究發(fā)現(xiàn)，Hsp16.3在巨噬細胞中起重要作用。Hsp16.3是存在于MTB膜上的主要抗原蛋白［9］，在 MTB 休眠階段大量表達［10］。研究發(fā)現(xiàn)MTB Hsp16.3可以抑制巨噬細胞自噬體的形成［11］，抑制小鼠肺泡巨噬細胞的凋亡等［12］，但對巨噬細胞極化的功能及作用機制方面的研究較少。本實驗室在前期構(gòu)建了原核表達載體，并獲得經(jīng)鎳柱純化的MTB Hsp16.3，發(fā)現(xiàn)該蛋白對巨噬細胞功能具有重要的調(diào)控作用［13］。本研究旨在用 MTB Hsp16.3作用于小鼠骨髓來源的巨噬細胞，探討MTB Hsp16.3在體外細胞水平對M1型巨噬細胞的影響作用，為深入研究MTB Hsp16.3對巨噬細胞極化的作用及其機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 MTB Hsp16.3蛋白由本實驗室制備保存。BALB/c小鼠購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心;PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time、SYBR Premix Ex Taq購自TaKaRa公司;IL-10、iNOS和TNF-α ELISA試劑盒購自eBioscience公司;PCR引物合成由Invitrogen公司完成。

1.2 方法

1.2.1 骨髓來源的巨噬細胞收集及鑒定 將3只8周左右雄性BALB/c小鼠(25 g左右)脫臼處死，無菌取小鼠脛骨和股骨骨髓細胞，經(jīng)DMEM完全培養(yǎng)液緩慢沖洗2次，離心后加入DMEM完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度至1×106ml－1，培養(yǎng)第7天后去除非貼壁細胞，再用DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng);第8天后收集的貼壁細胞即為骨髓來源巨噬細胞。光鏡下觀察第8天巨噬細胞的形態(tài)，并消化收集細胞，用FITC標記的抗小鼠F4/80抗體、APC標記的抗小鼠CD11b抗體，4℃避光孵育30 min，流式檢測誘導(dǎo)成功的巨噬細胞比例。

1.2.2 用IFN-γ、IL-4分別誘導(dǎo)骨髓來源的巨噬細胞 將收集成熟的巨噬細胞接種于6孔細胞板上，參照 Vats等［14］的方法，以100 ng/ml IFN-γ 誘導(dǎo) M1型巨噬細胞，10 ng/ml IL-4誘導(dǎo)出M2型巨噬細胞，并設(shè)空白對照孔。置于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24、36、48 h。在光鏡下觀察巨噬細胞形態(tài)，并收集細胞培養(yǎng)上清和貼壁細胞。

1.2.3 MTB Hsp16.3蛋白刺激巨噬細胞 將對數(shù)生長期的M0和M1巨噬細胞以1×105個/ml的密度分別鋪于2個6孔板中，加入1 ml完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。待M0和M1巨噬細胞完全貼壁且生長狀態(tài)良好時，分別加入100 ng/ml MTB Hsp16.3刺激巨噬細胞［13］，并設(shè)空白對照孔，每組3個復(fù)空。置于5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72、96 h，培養(yǎng)后分別收集細胞培養(yǎng)液上清和貼壁細胞。

1.2.4 細胞總RNA抽提和逆轉(zhuǎn)錄 取上述培養(yǎng)后收集好的貼壁細胞，TRIzol法提取總RNA(按試劑盒說明書進行)，加入0.5 ml TRIzol，吹打混勻，Vortex 15 s，室溫靜置 3 min。加入 200 μl氯仿，Vortex 15 s，室溫靜置 3 min。4℃，12 000 r/min 離心 15 min，吸取上層無色水相，轉(zhuǎn)至新EP管中，加入等體積的異丙醇，充分混勻，室溫靜置10 min后，4℃ 12 000 r/min離心10 min，徹底棄上清，加入75%乙醇1 ml，室溫放置2 min。4℃ 7 500 r/min離心5 min，徹底棄上清，倒扣于紗布上(DEPC處理)10～15 min，每管加入50 μl焦碳酸二乙脂(DEPC)水溶解沉淀。采用紫外分光光度計測定所提RNA的濃度和純度。以總 RNA為模板，Oligo(dt)為引物，將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.5 qRT-PCR檢測巨噬細胞各細胞因子mRNA相對表達量 以上述反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行qRT-PCR(按照SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒說明書進行)，反應(yīng)體系:ddH2O 8.5 μl，SYBR 12.5 μl，cDNA 2 μl，上、下游引物(見表1)各 1 μl，總體積25 μl。反應(yīng)參數(shù):95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s;60℃ 30 s，40個循環(huán)。qRT-PCR實驗數(shù)據(jù)用2－ΔΔCt法(Ct為熒光達到閾值時所需 PCR 的循環(huán)數(shù))分析樣本 IL-12、TNF-α、iNOS、IL-10、TGF-β、Arg-1mRNA的相對表達量。

1.2.6 ELISA檢測巨噬細胞各細胞因子表達水平取上述培養(yǎng)后收集好的細胞培養(yǎng)上清，用ELISA檢測TNF-α、iNOS、IL-10、TGF-β 細胞因子的分泌。按照試劑盒說明加樣，置于37℃溫育60 min，加入稀釋30倍的洗滌液洗板5次，加顯色劑A、B，37℃避光顯色5～15 min后加入終止液，終止反應(yīng)。450 nm波長檢測吸光度(OD)值并測各細胞因子濃度。

2 結(jié)果

2.1 巨噬細胞的形態(tài) 光鏡下觀察骨髓來源的M0型巨噬細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞偽足較短(圖1A);M1型巨噬細胞形狀呈長梭形，并有偽足伸出現(xiàn)，突觸很長(圖1B);M2型巨噬細胞偽足較短，細胞整體形態(tài)較為收攏(圖1C)。FCM檢測有90%以上的骨髓細胞具有CD11b和F4/80雙陽性的特征(圖1D)，認為小鼠骨髓來源的巨噬細胞培養(yǎng)成功，適用于后續(xù)實驗。

2.2 巨噬細胞細胞因子的表達結(jié)果

2.2.1 巨噬細胞細胞因子mRNA表達水平 在體外培養(yǎng)條件下，用IFN-γ刺激骨髓來源巨噬細胞，誘導(dǎo)為M1型巨噬細胞。取貼壁細胞進行qRT-PCR，檢測不同時間點細胞因子mRNA的相對表達水平。所有擴增曲線均無非特異性熒光，融解曲線呈單峰，產(chǎn)物特異性好。結(jié)果顯示，M1型巨噬細胞IL-12、TNF-α 和iNOS mRNA(圖2A、B、C)的相對表達量較對照組顯著增加(P＜0.05)。M2型巨噬細胞IL-4、TGF-β、IL-10 和 Arg-1 mRNA(圖2D、E、F、G)的相對表達量較對照組顯著增加(P＜0.05)。

2.2.2 巨噬細胞細胞因子的分泌水平 取細胞培養(yǎng)上清進行ELISA檢測，結(jié)果顯示M1型巨噬細胞iNOS、TNF-α水平較對照組顯著升高(P＜0.05)，IL-10、TGF-β水平較對照組降低(P＜0.05)(圖3A、B);M2型巨噬細胞IL-10、TGF-β水平較對照組顯著增加(P ＜0.05)，iNOS、TNF-α 水平較對照組降低(P＜0.05)(圖3C、D)，與qRT-PCR結(jié)果一致。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

圖1 電鏡下巨噬細胞形態(tài)(×10)及流式檢測M0型巨噬細胞膜分子的表達Fig.1 Morphology of macrophages by light microscope(×10)and expression of macrophage membrane molecule by FCM

圖2 M1/M2型巨噬細胞細胞因子mRNA表達水平Fig.2 Expression levels of cytokine mRNA in M1/M2 macrophages

圖4 MTB Hsp16.3刺激M0巨噬細胞后細胞因子mRNA表達水平Fig.4 Expression levels of cytokines mRNA after MTB Hsp16.3 stimulated M0 macrophages

在體外成功構(gòu)建小鼠骨髓來源M1/M2型巨噬細胞的技術(shù)平臺，為進一步研究結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3在體外細胞水平對M1型巨噬細胞的影響提供了良好的技術(shù)平臺。

2.3 MTB Hsp16.3刺激巨噬細胞細胞因子的表達結(jié)果

2.3.1 MTB Hsp16.3刺激巨噬細胞后細胞因子mRNA表達水平 100 ng/ml MTB Hsp16.3分別刺激M0和M1型巨噬細胞，取貼壁細胞進行qRTPCR，檢測刺激后不同時間點細胞因子mRNA的相對表達水平。結(jié)果顯示:MTB Hsp16.3刺激的M0型巨噬細胞 IL-10、TGF-β(圖4A、B)的相對表達水平較對照組顯著增加(P＜0.05)，在第72小時達到最高。iNOS、TNF-α(圖4C、D)的相對表達水平明顯降低(P＜0.05)，分別在第48、24小時達到最低;M1型巨噬細胞 IL-10、TGF-β(圖5A、B)的相對表達水平較對照組顯著增加(P＜0.05)，在第72小時達到最高。iNOS、TNF-α(圖5C、D)的相對表達水平明顯降低(P＜0.05)，在第72小時達到最低。

2.3.2 MTB Hsp16.3刺激巨噬細胞后細胞因子的分泌水平 取最高或最低表達量時間點的細胞培養(yǎng)上清進行ELISA檢測。結(jié)果顯示:M0型巨噬細胞IL-10和TGF-β水平顯著增加(P＜0.05)，iNOS和TNF-α水平明顯降低(P＜0.05)(圖6A、B);M1型巨噬細胞 IL-10和 TGF-β水平顯著增加(P＜0.05)，iNOS和TNF-α水平明顯降低(P＜0.05)(圖6C、D)。上述各細胞因子ELISA結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致，提示MTB Hsp16.3抑制了M1型巨噬細胞炎癥因子的表達，同時能誘導(dǎo)M1表型巨噬細胞向M2型樣巨噬細胞轉(zhuǎn)換。

圖5 MTB Hsp16.3刺激M1巨噬細胞后細胞因子mRNA表達水平Fig.5 Expression levels of cytokines mRNA after MTB Hsp16.3 stimulated M1 macrophages

圖6 MTB Hsp16.3刺激巨噬細胞后細胞因子的分泌水平Fig.6 Levels of cytokines after MTB Hsp16.3 stimulated macrophages

3 討論

MTB入侵宿主后主要在巨噬細胞內(nèi)寄生，在機體抗MTB免疫過程中巨噬細胞起重要作用。巨噬細胞的功能狀態(tài)具有連續(xù)性，這一連續(xù)狀態(tài)兩個極端是M1型即經(jīng)典活化的巨噬細胞(Classically activated macrophage)和M2型即選擇性活化的巨噬細胞(Alternatively activated macrophage)［15］。大量研究發(fā)現(xiàn)，M1型巨噬細胞通過分泌趨化因子和促炎性細胞因子，發(fā)揮清除病原體的功能;M2型巨噬細胞通過分泌抑制性細胞因子，在組織修復(fù)和促腫瘤發(fā)生發(fā)揮重要作用。在MTB感染的小鼠模型中，長期感染誘導(dǎo)了肺泡巨噬細胞由M1型逐漸向M2型轉(zhuǎn)變［16］。根據(jù)已有文獻報道［17］，M1 型巨噬細胞可以分泌IL-12、TNF-α等因子，高表達精氨酸代謝途徑關(guān)鍵酶iNOS，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，發(fā)揮宿主免疫功能;M2型巨噬細胞可分泌TGF-β、IL-10等因子，高表達精氨酸代謝途徑關(guān)鍵酶Arg-1，在炎癥反應(yīng)后期發(fā)揮抗炎作用，促進組織修復(fù)和纖維變性。同時發(fā)現(xiàn)許多物質(zhì)可誘導(dǎo)巨噬細胞的極化，如單核趨化蛋白-1(Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)可誘導(dǎo)巨噬細胞向M1極化;巨噬細胞內(nèi)脂肪酸的感受器-PPAR(Peroxisome proliferator activated receptor)中PPARα、熱休克蛋白70家族的分子伴侶DnaK均可誘導(dǎo)巨噬細胞向M2型極化。

近年研究發(fā)現(xiàn)，小分子熱休克蛋白家族中的Hsp16.3在結(jié)核桿菌潛伏宿主巨噬細胞的過程中扮演重要角色。Hsp16.3是由MTB HspX基因編碼的蛋白，為α-晶體超家族成員，由144個氨基酸組成，分子質(zhì)量為16.3 kD，主要潛伏于宿主巨噬細胞中。早期 Castillo等［18］建立雷帕霉素自噬模型，發(fā)現(xiàn)Hsp16.3的表達活性增至原來的80倍，干擾了巨噬細胞自噬體的形成。而敲除Hsp16.3基因后得到的突變菌株沒有Hsp16.3的表達，無法在骨髓衍生的巨噬細胞中生長。姚楠等［12］建立結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細胞RAW264.7模型，發(fā)現(xiàn)MTB感染導(dǎo)致巨噬細胞凋亡，且在感染早期強毒力結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3的表達水平較高。發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白16.3與巨噬細胞之間有著重要的關(guān)系。

本實驗室在前期構(gòu)建了原核表達載體，并獲得經(jīng)鎳柱純化的MTB Hsp16.3，用MTB Hsp16.3作用巨噬細胞株RAW264.7，發(fā)現(xiàn)該蛋白對巨噬細胞株RAW264.7功能具有重要的調(diào)控作用［13］，本研究旨在前期研究的基礎(chǔ)上，用MTB Hsp16.3作用于小鼠骨髓來源的巨噬細胞，探討結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3在體外細胞水平對M1型巨噬細胞的影響作用。

實驗結(jié)果顯示:小鼠骨髓細胞來源的M0型巨噬細胞，流式檢測CD11b和F4/80膜分子表達，發(fā)現(xiàn)有90%以上的骨髓細胞細胞具有CD11b和F4/80雙陽性的特征;熒光定量PCR、ELISA檢測IFN-γ、IL-4誘導(dǎo)M0型巨噬細胞后各組細胞因子的表達情況，顯示M1型巨噬細胞高表達IL-12、TNF-α、iNOS，M2 型巨噬細胞高表達 IL-4、TGF-β、IL-10、Arg-1。光鏡下觀察M0型巨噬細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞偽足較短;M1型巨噬細胞形狀呈長梭形，并有偽足伸出現(xiàn)，突觸很長;熒光定量 PCR、ELISA檢測 MTB Hsp16.3分別刺激M0和M1型巨噬細胞后各組細胞因子的表達情況，結(jié)果顯示巨噬細胞IL-10、Arg-1、TGF-β mRNA水平較對照組顯著增加，而 iNOS、TNF-α mRNA水平明顯降低，且在48-72 h時增加或降低的水平達到最適濃度。初步研究結(jié)果表明，實驗成功誘導(dǎo)了小鼠骨髓來源的M1、M2型巨噬細胞;結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3促進M1型巨噬細胞高表達M2型相關(guān)的細胞因子，可促進M1型巨噬細胞向M2型樣細胞轉(zhuǎn)換。研究結(jié)果可為深入研究MTB Hsp16.3對巨噬細胞極化的作用及其機制奠定基礎(chǔ)，有助于闡明MTB慢性感染巨噬細胞極化的分子機制，為結(jié)核病免疫防治提供合適的候選分子靶點。

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