Th1-Tp-Th17細(xì)胞因子在小鼠慢性心肌炎中的表達(dá)①

曾曉春孔清伍偉鋒

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，南寧530021)

①本文為國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81160032)。

[摘要]目的：觀察Th1-Tp-Th17細(xì)胞因子在小鼠慢性心肌炎(VMC)模型中的表達(dá)，探究其在慢性VMC中的作用及其意義。方法：用柯薩奇病毒 B3(CVB3)建立BALB/c VMC 小鼠模型，實(shí)驗(yàn)組(n=15)腹腔注射磷酸緩沖液(Phosphate-buffered saline，PBS)0.1 ml，含102TCID50 CVB3 病毒液；對(duì)照組(n=10)腹腔注射PBS 0.1 ml，不含病毒液。在注射后的第8周，心肌HE染色觀察其病理形態(tài)特征；Masson′s染色法觀察心肌組織纖維化程度；檢測(cè)血漿中Th1-Tp-Th17細(xì)胞因子含量及心肌組織中上述細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果：病毒感染8周后心肌病理符合慢性VMC病理特征；與對(duì)照組比較，血漿及心肌中IL-2、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21及TGF-β均明顯升高(P均<0.05)。結(jié)論：Th1-Tp-Th17細(xì)胞因子失衡導(dǎo)致的免疫紊亂可能在慢性VMC發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

[關(guān)鍵詞]細(xì)胞因子；免疫紊亂；慢性心肌炎

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.12.004

中圖分類號(hào)R329.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

作者簡介：曾曉春(1974年-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事心臟電生理、肺動(dòng)脈高壓方面研究，E-mail:zengxiaochun_222@163.com。

通訊作者及指導(dǎo)教師：伍偉鋒(1965年-)，男，博士，教授，主要從事心臟電生理、肺動(dòng)脈高壓方面研究,E-mail:wuweifeng196512@163.com。

Expressions of Th1-Tp-Th17 cytokines in mice chronic viral myocarditis

ZENGXiao-Chun,KONGQing,WUWei-Feng.DepartmentofCardiology，theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity，GuangxiCardiovascularInstitute,Nanning530021，China

Abstract[]Objective:To investigate the expressions of Th1-Tp-Th17 cytokines in the coxsackievirus B3-induced mice chronic viral myocarditis(VMC).Methods: BALB/c mice were intraperitoneally(i.p) infected with increased CVB3 for establishing chronic VMC models.Control mice were treated with phosphate-buffered saline(PBS)i.p.Cardiac tissues were obtained 8 weeks after CVB3 injection，myocardial histopathologic changes were observed by HE and Masson staining.Th1-Tp-Th17 cytokines in plasma were detected by protein array technology，and their cardiac mRNA expressions were measured by RT-PCR.Results: Compared with the control group，levels of IL-2，IL-5，IL-10，IL-13，IL-17，IL-6，IL-22，IL-21 and TGF-β obviously increased in chronic VMC group(P all<0.05).Conclusion: The imbalance of Th1-Tp-Th17 cytokines may play an important roles in the pathogenesis of chronic VMC.

[Key words]Cytokine;Immune disorders;Chronic viral myocarditis

病毒性心肌炎(VMC)是病毒感染引起的心肌局灶性或彌漫性炎癥病變，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種病毒可誘發(fā)VMC，其中主要是腸道病毒，包括CoxA 和B組病毒，ECOH、脊髓灰質(zhì)炎病毒等，其中以柯薩奇B組病毒3(CVB3)最為常見。病毒對(duì)心肌的直接攻擊以及機(jī)體的免疫反應(yīng)，比如多種細(xì)胞因子異常表達(dá)導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷是VMC發(fā)病的重要機(jī)制以及部分VMC慢性化，甚至進(jìn)展為擴(kuò)張型心肌病(DCM)的原因[1，2]。CVB3注射后的BALB/c小鼠的疾病進(jìn)展經(jīng)歷急性VMC、慢性VMC以及DCM，是研究人類VMC的重要實(shí)驗(yàn)對(duì)象。慢性VMC在心肌炎向心肌病轉(zhuǎn)變過程的中段，所以能早期識(shí)別慢性心肌炎異常表達(dá)的細(xì)胞因子有重要意義。大量研究報(bào)道，輔助性T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是本病的重要因素之一，心肌炎病情進(jìn)展和嚴(yán)重程度與T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子密切相關(guān)。已有研究證實(shí)Th1、Tp、Th17這3種細(xì)胞及其細(xì)胞因子在急性VMC的發(fā)生中起重要作用[1-3]，然而，它們?cè)诼訴MC中的表達(dá)未見報(bào)道。我們通過檢測(cè)慢性VMC小鼠Th1-Tp-Th17細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá)水平，探討Th1-Tp-Th17細(xì)胞因子平衡動(dòng)態(tài)變化及其在慢性VMC發(fā)病中的意義。

1材料與方法

1.1材料樣本SPF 級(jí)雄性BALB/c小鼠。來源：國家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心湖南分中心(斯萊克景達(dá)公司)。許可證號(hào)0062353-SCXK(X)2009-0004。CVB3 Nancy 株：我校微生物教研室提供。蛋白芯片：美國RayBiotech公司。Trizol：美國Invitrogen公司。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒：加拿大Fermentas公司。聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒：加拿大Fermentas公司。PCR引物合成：上海生工生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1VCM小鼠模型的建立及分組CVB3 Nancy 株的50%組織培養(yǎng)感染濃度 TCID50 為10-7。25只雄性BALB/c小鼠參與本實(shí)驗(yàn)，其中實(shí)驗(yàn)組15只，腹腔注射磷酸緩沖液(Phosphate-buffered saline，PBS)0.1 ml，含102TCID50 CVB3 病毒液；對(duì)照組10只，腹腔注射PBS 0.1 ml，不含病毒液。接種病毒后第1天開始記錄，于8周后(第56天)處死小鼠并留取心臟及血清，血清進(jìn)行蛋白芯片檢測(cè)，心臟組織一部分提取總RNA，另一部分進(jìn)行蘇木素-伊紅(Hematoxylin-Eosin，HE)及Masson染色。

1.2.2心肌組織病理學(xué)檢查取兩組小鼠心肌組織，進(jìn)行HE及Masson染色，光鏡下觀察組織病理改變。HE染色觀察炎性細(xì)胞浸潤及壞死情況。Masson染色觀察心肌膠原纖維情況。

1.2.3血漿細(xì)胞因子的蛋白含量檢測(cè)烘干蛋白玻片芯片，分別將100 μl的樣品稀釋液注入每個(gè)孔中，室溫下進(jìn)行30 min孵育，將抗體芯片封閉。將每個(gè)孔中緩沖液吸出后添加100 μl的標(biāo)準(zhǔn)液和樣品，室溫下進(jìn)行2 h搖床孵育，再將每個(gè)孔中的標(biāo)準(zhǔn)液和樣品吸出。后依次添加80 μl檢測(cè)抗體、80 μl的Cy3-鏈霉親和素到每個(gè)孔中，室溫?fù)u床上孵育，注意每次均應(yīng)反復(fù)清洗，最終用Axon GenePix激光掃描儀掃描信號(hào)。

1.2.4心肌細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)檢測(cè)用Trizol試劑提取2組小鼠心肌組織中的總RNA。在 PCR反應(yīng)管中加入3 μg總 RNA+ 1 μl oligo引物+DEPC水，加溫至 70℃ 5 min使其變性后迅速降至0℃。離心后加入4 μl 5×RT 緩沖液+2 μl 10 mmol/L dNTPmix +1 μl RNA 酶抑制劑+1 μl逆轉(zhuǎn)錄酶，離心后42℃ 溫育1 h，再加溫至70℃10 min ，-20℃凍存合成的cDNA。利用PCR反應(yīng)對(duì)目的基因以及β-actin進(jìn)行擴(kuò)增，PCR管反應(yīng)體系包括cDNA 1 μl+上下游引物各0.6 μl+SYBR solution 10 μl+去離子水7.8 μl，擴(kuò)增和熒光信號(hào)收集均采用ABI7500熒光定量PCR檢測(cè)儀。加熱至94℃ 3 min，降至60℃ 30 s，再加熱至72℃ 60 s，循環(huán)35次并采集熒光生成擴(kuò)增曲線和65℃～95℃緩慢升溫的熔解曲線，最后72℃總延伸10 min。同步檢測(cè)β-actin拷貝數(shù)，利用2-ΔΔCt計(jì)算組間相差的倍數(shù)。上海生工生物技術(shù)有限公司合成引物獲得IL-2、IL-5等目的基因及β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)基因序列，見表1。

2結(jié)果

2.1兩組小鼠一般情況感染CVB3后，實(shí)驗(yàn)組小鼠均出現(xiàn)皮毛紊亂，活動(dòng)減少，淡漠或易激惹等癥狀，到第8周時(shí)死亡4只小鼠。對(duì)照組小鼠無異常表現(xiàn)，無死亡。

2.2心肌組織病理學(xué)檢查病毒感染8周后，心臟切片染色發(fā)現(xiàn)有少量炎癥細(xì)胞浸潤，心肌間有結(jié)締組織增生病變，壞死心肌處在修復(fù)階段，提示心肌炎進(jìn)入慢性期。對(duì)照組未見炎性細(xì)胞浸潤及明顯纖維增生，見圖1。

2.3兩組小鼠細(xì)胞因子蛋白表達(dá)水平蛋白芯片結(jié)果顯示，慢性VMC組中血漿IL-22、IL-2、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、IL-21及TGF-β的表達(dá)量均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。而與對(duì)照組比較，慢性VMC組IL-1β、IL-4、IL-12p70、IL-13、IL-23、IL-28、IFN、MIP-3a、TNF的含量，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表1引物序列表

Tab.1Primer sequences of cytokines and β-actin

CytokinesPrimersequencesTmIL-225'CGATTGGGGAACTGGACCTG3'60℃[GenBank:50929]5'GGACGTTAGCTTCTCACTTT3'IL-25'TTGAGTGCCAATTCGATGATGAG3'60℃[GenBank:16183]5'TTGAGATGATGCTTTGACAGAAGG3'IL-55'AGACGGAGGACGAGGCAGTT3'60℃[GenBank:16191]5'TGCAACGAAGAGGATGAGGG3'IL-65'ACAGAAGGAGTGGCTAAGGACC3'60℃[GenBank:16193]5'TAGGCATAACGCACTAGGTTT3'IL-105'TGGCTCAGCACTGCTATGCT3'60℃[GenBank:16153]5'ATGGCCTTGTAGACACCTTG3'IL-135'TCTGTGTAGCCCTGGATTCCC3'60℃[GenBank:16163]5'CCGTGGCGAAACAGTTGCTT3'IL-175'GTGTCTCTGATGCTGTTG3'48℃[GenBank:16171]5'AACGGTTGAGGTAGTCTG3'IL-215'CGCCTCCTGATTAGACTTCG3'60℃[GenBank:60505]5'TGGGTGTCCTTTTCTCATACG3'TGF-β5'GAAGTGGATCCACGAGCCCAAG3'60℃[GenBank:21803]5'GCTGCACTTGCAGGAGCGCAC3'β-actin5'CCAGCCTTCCTTCTTGGGTAT3'60℃[GenBank:11461]5'TTGGCATAGAGGTCTTTACGG3'

表2慢性VMC組與對(duì)照組細(xì)胞因子蛋白表達(dá)的比較

Tab.2Comparison of cytokines expression between chronic VMC and control groups

CytokinesChronicVMCgroup(n=11)Controlgroup(n=10)PvalueIL-1β12.8±4.516.2±4.10.067IL-2112.2±12.183.9±13.90.002IL-45.3±1.85.8±0.80.59IL-572.4±18.452.6±12.80.002IL-636.1±9.921.1±8.80.003IL-10241.1±38.5195.3±25.30.042IL-12p70NTNTIL-1321.2±7.315.0±4.80.000IL-1756.4±12.758.5±9.90.769IL-21441.5±99.645.3±17.30.000IL-22150.4±24.372.6±21.10.000IL-23964.9±346.11221.4±428.80.865IL-2860.1±13.853.5±12.10.845IFN192.4±70.4207.4±50.30.249MIP-3aNTNTTGF-β74.7±21.9NT0.000TNF10.3±2.78.7±2.10.051

Note：NT.Not detected.

表3慢性VMC組與對(duì)照組細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的比較

Tab.3Comparison of cytokines mRNA expression between chronic VMC and control groups

CytokinesChronicVMCgroup(n=11)Controlgroup(n=10)PvalueIL-24.4±0.81.2±0.30.002IL-53.2±1.11.3±0.30.041IL-62.6±0.71.1±0.20.002IL-108.2±2.31.2±0.20.012IL-136.5±0.71.2±0.30.043IL-17F4.7±1.71.3±0.20.037IL-218.5±0.91.1±0.30.000IL-223.8±0.91.1±0.40.012TGF-β2.6±0.81.2±0.30.031

圖1　小鼠心肌病理改變(×400) Fig.1　Pathological changes of heart tissue(×400) Note: Lots of inflammatory cells and myocardical fibrosis were observed in chronic VMC group(HE and Masson),but inflammation and myocardial collagen fibers were not obvious in control group.

2.4兩組小鼠細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平RT-PCR結(jié)果顯示，慢性VMC組中心肌IL-22、IL-2、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17A、IL-21、TGF-β的mRNA表達(dá)量均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表3。

3討論

目前大量研究已經(jīng)證實(shí)，VMC發(fā)病機(jī)制主要包括兩方面[1，2]：(1)感染病毒后，心肌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量復(fù)制病毒并遭受病毒攻擊，造成心肌損傷；(2)細(xì)胞免疫、體液免疫是病毒感染后介導(dǎo)心肌細(xì)胞損害的兩個(gè)重要途徑。T淋巴細(xì)胞如Th1-Tp-Th17細(xì)胞是參與眾多自身免疫及感染性疾病的免疫細(xì)胞，主要通過分泌相關(guān)的細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能[1-3]，并可互相作用形成免疫網(wǎng)絡(luò)，放大免疫反應(yīng)。本研究觀察的對(duì)象是感染病毒后8周的小鼠，旨在探討慢性VMC小鼠Th1-Tp-Th17細(xì)胞因子的表達(dá)及意義，為臨床慢性VMC患者的診斷提供生物學(xué)標(biāo)記物的參考依據(jù)，同時(shí)為臨床心肌炎的免疫抑制治療提供參考。基于此，本研究利用蛋白芯片，結(jié)果表明，Th1細(xì)胞主要相關(guān)因子IL-2，Tp細(xì)胞主要相關(guān)因子IL-5、IL-10及IL-13，Th17細(xì)胞主要相關(guān)因子IL-17、IL-6、IL-22、IL-21及TGF-β的蛋白水平在慢性VMC中明顯升高，且對(duì)應(yīng)的mRNA水平亦高表達(dá)，提示其與慢性VMC的免疫損傷機(jī)制有關(guān)。

IL-2是活化的CD4+Th1細(xì)胞產(chǎn)生的具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子，過度表達(dá)的IL-2可通過誘導(dǎo)T細(xì)胞激酶(ITK)進(jìn)一步激活T細(xì)胞，加重心肌免疫損傷，甚至引起爆發(fā)性心肌炎[4]。病毒感染后激活Tp細(xì)胞并刺激后者分泌細(xì)胞因子，其中，IL-5加強(qiáng)嗜酸性粒細(xì)胞的聚集和活化，而IL-10對(duì)促炎因子如TNF-α、IL-1、IL-6等具有廣泛的抑制作用，其主要生物學(xué)活性是免疫抑制和抗炎，對(duì)心肌起積極的保護(hù)作用[5，6]。而Tp細(xì)胞另一重要分泌的因子——IL-13，也在心肌炎中起重要的抑制炎癥作用。Cihakova等[7]利用IL-13基因敲除小鼠，證實(shí)IL-13可抑制促炎和促纖維化因子如IL-1β、IL-18、TGF-β、組胺等，并延緩心肌重塑，抑制心肌炎向心肌病發(fā)展。

大量研究證實(shí)Th17細(xì)胞參與VMC發(fā)病過程，本課題組亦發(fā)現(xiàn)IL-17可加劇心肌炎癥發(fā)展[8]，加重心肌的纖維化程度[9]。我們的部分結(jié)果也在其他報(bào)道得到了證實(shí)，如在混合性CVB3模型中，增高的慢性纖維化和擴(kuò)張型心肌病的概率，與心肌IL-17的表達(dá)水平在急性期升高明顯相關(guān)[10]。IL-22通過作用于心臟成纖維細(xì)胞等非炎癥非心肌細(xì)胞[11]，在心肌炎中起重要的心肌保護(hù)及抑制病毒復(fù)制作用。而IL-21可由IL-6誘導(dǎo)產(chǎn)生，能擴(kuò)大初始及獲得性免疫，促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化和及分泌[12]。此外，在眾多細(xì)胞因子中，慢性VMC中IL-21升高的倍數(shù)最大，約達(dá)10倍，其是否能作為診斷慢性VMC的生物學(xué)標(biāo)記物仍需在臨床中進(jìn)一步證實(shí)[13]。

4結(jié)論

Th1-Tp-Th17細(xì)胞因子如IL-2、IL-21等在小鼠慢性VMC中明顯升高，提示細(xì)胞因子失衡導(dǎo)致的免疫紊亂可能在慢性VMC發(fā)病機(jī)制中起重要作用。需注意的是細(xì)胞因子的產(chǎn)生及生物學(xué)作用具有網(wǎng)絡(luò)特點(diǎn)，協(xié)調(diào)機(jī)體免疫平衡。重建和維持Th1-Tp-Th17細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)平衡，可能是治療慢性VMC并阻止其向DCM進(jìn)展的有效途徑。

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[收稿2015-05-02二次修回2015-07-15]

(編輯倪鵬)

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