劉國安，李杰林，李雙越，葉金鳳，丁　蘭

(西北師范大學生命科學學院，甘肅蘭州　730070)

維生素C和維生素E的聯(lián)合抗氧化活性研究

劉國安，李杰林，李雙越，葉金鳳，丁蘭

(西北師范大學生命科學學院，甘肅蘭州730070)

摘要：維生素C和維生素E具有多種生理活性，也是抗氧化劑，二者聯(lián)合作用的生化機理研究鮮見報道.本文采用鐵氰化鉀法、甲基紫法、鄰苯三酚自氧化法和DMPD法，檢測了維生素C和維生素E單獨及聯(lián)合作用后的還原力、對DMPD·+自由基、羥自由基和超氧陰離子的清除能力；采用SDS-PAGE法和SCGE法檢測了二者對蛋白質(zhì)和細胞DNA氧化損傷的保護作用.結(jié)果表明，維生素C和維生素E在各個體系中具有較強的作用，并呈濃度依賴性.維生素C在還原能力、清除自由基能力方面比維生素E強，二者的聯(lián)合作用大多強于單獨作用，表現(xiàn)出一定的協(xié)同增效作用.同時，維生素C和維生素E在AAPH引起的蛋白質(zhì)氧化損傷中也有很好的保護作用，二者聯(lián)合后作用效果更明顯，但在對細胞DNA 的氧化損傷中未見協(xié)同保護作用.

關(guān)鍵詞：維生素C；維生素E；自由基；抗氧化活性；聯(lián)合作用

維生素C(Vitamin C，VC)又名抗壞血酸，是水溶性維生素，主要用于預防和治療壞血病.VC是一種強抗氧化劑，在清除自由基和抗氧化方面發(fā)揮重要作用[1,2].維生素E(Vitamin E，VE)又稱生育酚，是脂溶性維生素，有抗不育、抗衰老等生理功能.VE也是強抗氧化劑，在體內(nèi)外通過多種機制發(fā)揮抗氧化作用[3,4].盡管VC和VE的抗氧化作用在國內(nèi)外有大量的報道，但大多是單獨作用或是在單一體系下的檢測，并且基本是在細胞體系或在整體水平的研究[5,6]，而聯(lián)合作用研究報道不多.作為具有抗氧化活性的水溶性維生素和脂溶性維生素，VC和VE的聯(lián)合作用具有很大的應用潛力.

自由基(Free radical)是機體生命活動中各種生化反應產(chǎn)生的正常中間代謝產(chǎn)物，在生物體內(nèi)發(fā)揮重要生理作用.在正常生理情況下，自由基的產(chǎn)生和消除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，但過量積聚時又會嚴重傷害生物膜、酶、維生素、蛋白質(zhì)及活細胞功能，進而影響生物體的正常功能.衰老、癌癥及許多疾病都與過量產(chǎn)生的自由基有關(guān)[7].

本文對VC和VE在多種體系下共同作用后的抗氧化活性進行了檢測，以期揭示兩種維生素抗氧化作用的互補性.實驗通過檢測VC和VE單獨以及聯(lián)合作用后的還原能力，對DMPD·+自由基、羥自由基、超氧陰離子的清除作用和對蛋白質(zhì)和細胞DNA氧化損傷的保護作用，對二者的聯(lián)合抗氧化機理的研究及其進一步應用提供一定的理論依據(jù).

1材料與方法

1.1材料

牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)(陜西華美生物科技有限公司產(chǎn)品)；DMPD(N，N-二甲基-對苯二胺)、AAPH(2，2-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽)、BHT(2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚)、Tris(三羥甲基氨基甲烷)和SDS(均為Sigma公司產(chǎn)品).

1.2方法

1.2.1維生素E的乳化本文所有檢測體系均為水體系，而VE為脂溶性化合物，故需對其進行乳化，以使其更好地參與反應.乳化方法參照沙棘油的乳化[8]，以VE作油相，取1 mL VE與55 μL司盤80不斷吸打，使分散均勻.水浴55~60 ℃保溫60 min，在此期間每5 min吸打一次.另取115 μL吐溫80、230 μL乳化劑OP-10和200 μL丙二醇溶于9 mL 55~60 ℃蒸餾水中，搖勻后緩慢加入上述保溫60 min的油相中，繼續(xù)每5 min吸打一次，使其分散均勻，10~15 min后制成初乳.

1.2.2還原力的測定還原劑將三價鐵(Fe3+)還原成二價鐵(Fe2+)后，F(xiàn)e2+與鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)生成可溶性藍色配合物KFe[Fe(CN)6]，在700 nm處有最大光吸收.化合物還原力越強，形成的KFe[Fe(CN)6]越多，吸光度越大，故吸光度與還原力呈正比關(guān)系.

還原力的測定參照Oyaiuz[9]的實驗方法，稍加修改.在1 mL樣品溶液中分別加人2.5 mL 0.2 mol·L-1pH6.6的PBS和1%K3Fe(CN)6溶液后搖勻，50 ℃水浴20 min，然后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸，混合物在4 000 r·min-1下離心10 min后取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和1 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，靜置10 min后在700 nm處測定吸光值，吸光值越大表明化合物還原力越強.

1.2.3清除DMPD·+自由基能力的測定DMPD在酸性條件下可被FeCl3、CuCl2或H2O2等氧化生成穩(wěn)定有顏色的DMPD·+，它在505 nm處有最大吸收峰，而抗氧化劑能轉(zhuǎn)移1個氫原子給DMPD·+使其溶液脫色，脫色程度越強，說明其抗氧化能力越強.

DMPD·+自由基清除能力根據(jù)劉國安等[10]的方法測定，取100 mmol·L-1的DMPD溶液和0.1 mol·L-1pH 5.25的醋酸鹽緩沖液混勻，加入0.05 mol·L-1的FeCl3溶液啟動反應后產(chǎn)生DMPD·+自由基溶液.取1 mL DMPD·+溶液，加0.5 mL樣品溶液，25 ℃反應10 min，在505 nm處測吸光值.DMPD·+清除率=(1-A1/A2)×100%.其中，A2為DMPD·+初始濃度的吸光值；A1為加入待測樣品后剩余DMPD·+濃度的吸光值.

1.2.4清除羥自由基能力的測定Fenton反應是以H2O2為氧化劑，以Fe2+為催化劑的氧化體系：Fe2++ H2O2→Fe3++OH-+·OH.產(chǎn)生的羥自由基(·OH)與甲基紫作用后使后者因氧化而吸光度降低，而抗氧化劑可清除·OH使其吸光度回升，故利用吸光值的變化可測定待測物對·OH的清除作用.

·OH清除能力的測定參照劉立明等[11]的方法.在試管中分別加入1 mL pH4.7的Tris-HCl、1 mL甲基紫溶液(1.03×10-5mol·L-1)、1 mL樣品溶液、1 mL FeSO4溶液(1×10-3mol·L-1)和1 mL H2O2(1.6 mol·L-1)溶液，搖勻后放置5 min，在波長582 nm處測定吸光值.羥自由基清除率=[1-(A0-A2)/(A0-A1)]×100%，其中，A0為未加Fe2+和H2O2時的吸光值；A1為未加清除劑時的吸光值；A2為加入清除劑時的吸光值.

1.2.6對蛋白質(zhì)氧化損傷的保護作用在自由基引發(fā)劑AAPH的作用下，BSA會被氧化降解，當有保護劑存在時可抑制這種降解作用.通過SDS-PAGE電泳檢測蛋白質(zhì)被降解的情況，可判斷不同抗氧化劑對蛋白質(zhì)氧化降解的保護能力.

實驗根據(jù)Kwon等[13]的方法.取5 μg BSA溶于0.2 mol·L-1PBS中，由20 mmol·L-1AAPH啟動氧化反應.處理組加入不同濃度的樣品，對照組用PBS代替.37 ℃水浴孵育24 h后，加入0.02% BHT終止反應.產(chǎn)物進行常規(guī)SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍R-250染色制干板并照相.

1.2.7單細胞凝膠電泳檢測對人外周血單核細胞DNA損傷的保護作用分離健康人外周血單核細胞，將樣品與細胞置于37 ℃孵育20 min.用4 ℃ 50 μmol·L-1H2O2處理5 min，細胞于1 000 r·min-1離心8 min，用PBS洗2遍，制成細胞懸液.根據(jù)LIU等[14]的實驗方法進行制片及電泳.在熒光顯微鏡下觀察細胞損傷情況：DNA沒有損傷的細胞呈圓形，損傷的細胞呈彗星狀，隨機選取視野統(tǒng)計損傷細胞數(shù)目，每樣作3張片子，每張片子至少隨機計50個細胞.細胞DNA損傷率=損傷細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%.保護劑對細胞的保護率=(A1-A2)/(A1-A0)×100%(A0為陰性對照損傷率，即未處理組；A1為陽性對照損傷率，即加入H2O2處理組；A2為實驗組損傷率，即先加入被測試劑再加入H2O2處理組)

1.2.8數(shù)據(jù)處理所有實驗重復至少3次，實驗結(jié)果以均值±誤差表示，用t檢驗進行差異顯著性分析，P<0.05為有統(tǒng)計學意義.

2結(jié)果

2.1VC和VE的還原力

兩種維生素的還原力結(jié)果見圖1和圖2.由圖可知，VC(圖1)的還原力比VE(圖2)的還原力強，并且隨著二者濃度的增加，吸光值不斷升高，表明其還原能力不斷增強，兩者活性都呈濃度依賴性.VC在20μmol·L-1時吸光值為0.24，在140μmol·L-1時達到了1.79.而VE在濃度為16mmol·L-1時其吸光值僅有0.59.由表1可知，20μmol·L-1的VC和100μmol·L-1的VC分別與不同濃度的VE聯(lián)合作用后，吸光值比單獨作用時的吸光值明顯增大，說明兩者聯(lián)合作用后還原力顯著增強.

圖1　VC的還原力

圖2　VE的還原力

2.2VC和VE對DMPD·+的清除作用

對DMPD·+自由基的清除作用見圖3和圖4，與還原力結(jié)果相似，VC(圖3)對DMPD·+自由基的清除作用比VE(圖4)強得多，50μmol·L-1時VC的清除率已經(jīng)達到了100%，而2 750μmol·L-1的VE清除率才91%.

表1　VC和VE聯(lián)合作用還原力

**P<0.01,與VC單獨作用相比較(ComparedwithVCalone)

圖3VC對DMPD·+自由基的清除作用

Fig3ScavengingactionofDMPD·+byVC

圖4　VE對DMPD·+自由基的清除作用

由表2可知，1μmol·L-1的VC與27.5μmol·L-1的VE聯(lián)合后的清除率為8%，與單獨作用的清除率相比差別不大，10μmol·L-1VC與275μmol·L-1的VE聯(lián)合后清除率為27%，比VC單獨作用的清除率低.說明VC和VE聯(lián)合作用后對DMPD·+自由基的清除沒有明顯的相互增效作用.

2.3VC和VE對羥自由基的清除作用

如圖所示，VC(圖5)對·OH具有很強的清除能力，并呈濃度依賴性.10μmol·L-1的VC清除率就達到了26%，隨著濃度升高，清除作用增強，當濃度為150μmol·L-1時其清除率達到97%.而VE(圖6)清除作用相對較弱，1mmol·L-1時清除率才達到70%.由表3可知，10μmol·L-1的VC和50μmol·L-1的VC分別與0.01mmol·L-1和0.05mmol·L-1的VE聯(lián)合作用后清除率與VC單獨作用的清除率相比沒有顯著差異，但0.25mmol·L-1的VE與VC聯(lián)合后清除率顯著增大，并且隨著VE濃度增大清除作用顯著增強，表現(xiàn)出了一定的協(xié)同效應.

表2　VC聯(lián)合VE對DMPD·+自由基的清除作用

*P<0.05，**P<0.01與VC單獨作用相比較(ComparedwithVCalone)

表3　VC聯(lián)合VE對羥自由基的清除作用

*P<0.05，**P<0.01,與VC單獨作用相比較(ComparedwithVCalone)2.4VC和VE對超氧陰離子清除作用

圖5　VC對羥自由基清除作用

圖6　VE對羥自由基清除作用

圖7　VC對超氧陰離子的清除作用

由表4可知，50μmol·L-1的VC和100μmol·L-1的VC分別與0.75mmol·L-1的VE聯(lián)合后，清除率分別為32%和50%，明顯比它們單獨作用的清除率高，并且隨VE濃度增大，聯(lián)合作用清除能力也顯著增強，表現(xiàn)出協(xié)同清除作用.

圖8　VE對超氧陰離子的清除作用

濃度Concentration清除率Clearance/%濃度Concentration清除率Clearance/%50μmol·L-1VC13.3±1.4100μmol·L-1VC28.5±6.950μmol·L-1VC+0.25mmol·L-1VE15.0±3.1100μmol·L-1VC+0.25mmol·L-1VE30.3±6.650μmol·L-1VC+0.50mmol·L-1VE22.3±4.7*100μmol·L-1VC+0.50mmol·L-1VE37.6±4.450μmol·L-1VC+0.75mmol·L-1VE32.3±5.3**100μmol·L-1VC+0.75mmol·L-1VE50.1±6.0**50μmol·L-1VC+1.00mmol·L-1VE46.1±4.1**100μmol·L-1VC+1.00mmol·L-1VE56.6±2.7**50μmol·L-1VC+1.25mmol·L-1VE59.9±4.3**100μmol·L-1VC+1.25mmol·L-1VE69.8±6.1**

*P<0.05，**P<0.01與VC單獨作用相比較(ComparedwithVCalone)

2.5VC和VE對AAPH引起牛血清白蛋白氧化損傷的保護作用

如圖9所示，對照(泳道1)牛血清白蛋白條帶清晰且顏色較深，用50mmol·L-1AAPH處理后蛋白質(zhì)氧化降解，電泳后條帶變淺或消失(泳道2)，VC(圖9：A)在低濃度時(0.1~0.001mmol·L-1)對蛋白質(zhì)的保護作用不明顯(泳道6~8)，隨著濃度的升高，保護作用加強，濃度為100mmol·L-1時幾乎完全保護了蛋白質(zhì)的氧化損傷(泳道3).VE(圖9：B)的保護作用很弱，100mmol·L-1時表現(xiàn)出一定的保護作用(泳道3)，濃度降低時(10~0.001mmol·L-1VE)只有很弱的作用(泳道5~8).VC和VE聯(lián)合(圖9：C)作用時，10mmol·L-1VC和不同濃度的VE(10~0.001mmol·L-1)聯(lián)合作用后，蛋白質(zhì)條帶與對照相比差別不大，對蛋白質(zhì)的保護作用很強(泳道3~7).而濃度為1mmol·L-1的VC和VE聯(lián)合后，較高濃度的VE(10mmol·L-1)作用較強(泳道8)，隨著VE濃度降低蛋白質(zhì)條帶與對照相比顏色變淺(泳道8~12)，說明對蛋白質(zhì)保護作用減弱.相比于VC、VE單獨保護作用，VC和VE聯(lián)合保護作用更強.

圖9VC和VE對由AAPH引起的BSA氧化降解的保護作用

Fig9TheinhibitioneffectofvitaminCandEonBSAoxidativefragmentationinducedbyAAPH

A.1.50μgBSA;2.50μgBSA+50mmol·L-1AAPH

3~8.50μgBSA+50mmol·L-1AAPH+100,10,1,0.1,0.01,0.001mmol·L-1VC

B.1.50μgBSA;2.50μgBSA+50mmol·L-1AAPH

3~8.50μgBSA+50mmol·L-1AAPH+100,10,1,0.1,0.01,0.001mmol·L-1VE

C.1.50μgBSA;2.50μgBSA+50mmol·L-1AAPH

3~7.50μgBSA+50mmol·L-1AAPH+10mmol·L-1VC+10,1,0.1,0.01,0.001mmol·L-1VE

8~12.50μgBSA+50mmol·L-1AAPH+1mmol·L-1VC+10,1,0.1,0.01,0.001mmol·L-1VE

2.6SCGE檢測VC和VE對H2O2引起的人單核細胞DNA損傷的保護作用

由表5結(jié)果可知，VC和VE在低濃度時均對由H2O2引起的人單核細胞DNA損傷有一定的保護作用，VC在低濃度時(5，10μmol·L-1)隨著濃度的增加對DNA的保護作用增強，但在高濃度時(50，500μmol·L-1)隨濃度的增加保護作用消失，并具一定損傷作用；VE在低濃度時(2.5，5，10mmol·L-1)也對DNA有一定的保護作用，但未見到呈濃度依賴性，濃度為25mmol·L-1時，表現(xiàn)出損傷作用.不同濃度的VC和VE聯(lián)合作用對DNA沒有保護作用反而有損傷作用(數(shù)據(jù)未顯示).

表5　VC和VE對細胞DNA氧化損傷的保護作用

3討論

研究發(fā)現(xiàn)氧化脅迫可引起衰老、癌癥、心腦血管疾病、老年癡呆癥等疾病的發(fā)生和發(fā)展.而抗氧化劑可清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化和多元不飽和脂肪酸的氧化變性，從而維持生物膜結(jié)構(gòu)和功能的完整，降低了由氧化損傷引起的多種疾病的發(fā)生，因此，抗氧化劑的使用可能會預防和治療與此相關(guān)的疾病.VC和VE分別是水溶性和脂溶性的抗氧化維生素，它們都具有很強的抗氧化能力.動物實驗表明，VC、VE和半胱氨酸或NAC共同作用明顯降低豚鼠體內(nèi)黑色素的生成和B16細胞中黑色素的含量，而且聯(lián)合作用活性遠大于VC單獨作用[15].VC和VE聯(lián)合使用可明顯增加大鼠肝臟和肌肉中過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽還原酶(GR)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)的活性，并且效果比單獨作用更顯著[16].VC和VE聯(lián)用在有些體系中能有效緩解機體的氧化脅迫狀態(tài)，但聯(lián)用是如何發(fā)揮作用，其生化機制未見報道.

上述實驗結(jié)果表明，VC和VE聯(lián)合作用后，總體來看抗氧化活性比單獨作用強，表現(xiàn)出一定的協(xié)同效應.VC和VE之間的相互作用和協(xié)同效應可能是在清除自由基過程中，VE可與自由基結(jié)合成生育酚自由基，而生育酚自由基又可與另一自由基反應生成非自由基產(chǎn)物-生育醌，進而發(fā)揮其抗氧化作用；而VC除了可以與自由基直接反應外，還可以把氧化型的維生素E還原成還原型維生素E，使其繼續(xù)發(fā)揮抗氧化作用[20]，這可能是兩者產(chǎn)生協(xié)同作用的重要原因.VC和VE聯(lián)用在不同體系中表現(xiàn)出優(yōu)異的抗氧化活性且效果強于單獨作用，這一結(jié)果對于揭示VC和VE聯(lián)合抗氧化機理、分析不同比例的VC和VE的聯(lián)用效果及其在臨床上的進一步應用會有所幫助.同時，隨著對其活性研究的深入，相信其在醫(yī)藥、保健食品及臨床應用等領域?qū)⒕哂懈訌V泛的應用.

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(責任編輯俞詩源)

E-mail:liuguoan@nwnu.edu.cn

Antioxidant activity studies of vitamin C and vitamin E

LIU Guo-an,LI Jie-lin,LI Shuang-yue,YE Jin-feng,DING Lan

(College of Life Science,Northwest Normal University,Lanzhou 730070,Gansu,China)

Abstract:Vitamin C and Vitamin E have many physiological activities，and both are antioxidant．However，their combinative actions in biochemistry system are rarely reported．In this paper，the methods of K3Fe(CN)6， methyl violet，pyrogallol autoxidation and DMPD·+are used to measure the reducing activity，the scavenging ability on hydroxyl radical，superoxide anion and DMPD·+of vitamin C and vitamin E treatment alone or combination．Moreover，the methods of SDS-PAGE and SCGE are used to detect the protein oxidative degradation and cell DNA damage．The results indicate that vitamin C and vitamin E exhibits significant antioxidant activities in different antioxidant systems，and the effect shows a concentration-dependent manner．Vitamin C exhibit stronger abilities of reducing and scavenging free radical than Vitamin E．The combination effect of two Vitamins shows stronger action than anyone alone in most systems，which presents synergistic interaction．In addition，both Vitamin C and Vitamin E play an important role in protecting protein from oxidative damage caused by AAPH，the effect become obvious when two compounds are combined．But their combinative protect actions have not been observed in cell DNA oxidative damage．

Key words:Vitamin C；Vitamin E；free radical；antioxidant activity；combinative action

中圖分類號：Q 564；Q 566

文獻標志碼：A

文章編號：1001-988Ⅹ(2015)02-0066-07

作者簡介：劉國安(1964—)，女，河北灤南人，教授，博士，碩士研究生導師.主要研究方向為生物化學與藥理學.

基金項目:國家自然科學基金資助項目(30960464);教育部留學回國人員科研啟動基金資助項目 國家自然科學基金資助項目(81060180,81360333)

收稿日期：2014-09-21;修改稿收到日期:2014-11-14 2014-05-12;修改稿收到日期:2014-12-16 2014-10-10;修改稿收到日期:2014-11-19