謝建平，岑山，劉鋼

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“病原微生物遺傳學(xué)研究進(jìn)展?？本幷呒恼Z

謝建平1，岑山2，劉鋼3

1.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院現(xiàn)代生物醫(yī)藥研究所，重慶 400715；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京 100050；3.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

在整個(gè)人類文明史上，微生物與人類如影隨形，恩怨情仇不斷。作為人類的朋友，微生物為我們的奶酪、面包、泡菜、啤酒、葡萄酒、抗生素以及免疫系統(tǒng)的發(fā)育等提供了重要的資源和動(dòng)力。另一方面，人類文明的發(fā)展史濃縮了與瘟疫的歷次戰(zhàn)役，如鼠疫、霍亂、流感、非典、埃博拉等。1845年至1852年間，致病疫霉()感染導(dǎo)致愛爾蘭人的主要糧食馬鈴薯腐爛，造成了歷史上著名的愛爾蘭饑荒，并對(duì)愛爾蘭的社會(huì)、文化、人口產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。其他動(dòng)物疾病如口蹄疫病毒、雞瘟病毒等都曾給畜牧業(yè)造成過巨大損失。

在生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)史上，微生物功勛卓著。微生物是現(xiàn)代生物學(xué)重大基礎(chǔ)理論建立的重要工具，如闡明DNA是主要遺傳物質(zhì)，中心法則的建立和完善，微生物都是主力工具。今天，無論是合成生物學(xué)還是表觀基因組學(xué)，微生物仍然作為先鋒，如人工合成脊髓灰質(zhì)炎病毒，或者創(chuàng)造性的細(xì)菌物種“Synthia”，為其他生物的研究提供借鑒?；蚪M編輯工具的革命性創(chuàng)新，仍然受到微生物的啟發(fā)或者是微生物的直接產(chǎn)物。如轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)技術(shù)源自黃單胞菌(sp.)侵襲植物所需的經(jīng)III型分泌系統(tǒng)分泌的TAL效應(yīng)因子(TAL effector, TALE)，CRISPR-Cas9系統(tǒng)與產(chǎn)膿鏈球菌()等細(xì)菌的免疫系統(tǒng)有關(guān)。在腫瘤新治療措施方面，工程改造的兼性厭氧的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌()與放射性元素如錸偶聯(lián)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明可控制轉(zhuǎn)移性胰腺癌。諾維氏梭菌()的孢子可以治療犬軟組織肉瘤。

抗生素是20世紀(jì)最偉大的醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)之一，其發(fā)現(xiàn)對(duì)人壽命的延長(zhǎng)至少貢獻(xiàn)了10歲。但是，抗生素耐藥問題日益嚴(yán)峻，幾乎每種抗生素都有耐藥菌。從1987年以后，再也沒有真正意義上的新抗生素上市。世界衛(wèi)生組織(WHO)2014年發(fā)布了關(guān)于抗生素危機(jī)的報(bào)告，包括6種傳染病和7種耐藥菌。6種傳染病是：肺結(jié)核、傷寒、淋病、梅毒、白喉，以及克雷伯氏菌所導(dǎo)致的感染如肺炎、尿道感染、敗血癥、腦膜炎和腹瀉等。7種耐藥菌為：耐第三代頭孢菌素和氟喹諾酮類抗生素的大腸桿菌，能耐第三代碳青霉烯類抗生素的肺炎克雷伯氏菌，耐甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌，耐青霉素的肺炎鏈球菌，耐氟喹諾酮類抗生素的非傷寒沙門氏菌和志賀氏菌(俗稱痢疾桿菌)，耐第三代碳青霉烯類抗生素的淋球菌。我們將可能進(jìn)入“后抗生素時(shí)代”，人們將死于以前可治愈的普通感染。為此，已有300年歷史的英國(guó)設(shè)獎(jiǎng)懸賞1000萬英鎊，以期找到解決抗生素耐藥性問題的對(duì)策。但某種意義上，抗生素耐藥性的威脅可能也是一個(gè)永無止境的挑戰(zhàn)。即使沒有抗生素作為選擇壓力，耐藥突變也會(huì)出現(xiàn)。永久凍土層中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌耐藥基因早已證實(shí)了這一點(diǎn)。微生物快速?gòu)?fù)制和變異的進(jìn)化優(yōu)勢(shì)，以及抗生素的普遍使用和過度濫用，進(jìn)一步加重了耐藥問題。在與致病微生物的博弈中，人類需要斗智斗勇。

本期?？褪窃谂c病原微生物的斗爭(zhēng)中，基礎(chǔ)研究與臨床醫(yī)生密切合作，尋找病原微生物致病和耐藥的分子遺傳機(jī)理，并積極轉(zhuǎn)化為感染性疾病預(yù)防、診斷和治療的工具的部分體現(xiàn)。本期涉及主要的病毒、細(xì)菌和真菌性疾病，也涉及基因組編輯 工具。

CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)是基于細(xì)菌或古細(xì)菌CRISPR 介導(dǎo)的獲得性免疫系統(tǒng)衍生而來，由一段RNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)識(shí)別DNA，指導(dǎo)Cas9 核酸酶切割識(shí)別的雙鏈DNA，誘發(fā)同源重組或非同源末端鏈接，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)在目的DNA 上進(jìn)行編輯。病毒通過特異的受體侵染細(xì)胞，其基因組在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程完成其生活周期，某些DNA 病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組會(huì)整合到宿主基因組中。基因治療是病毒感染疾病治療的新趨勢(shì)。因此，基因編輯技術(shù)在持續(xù)感染的病毒或潛伏感染病毒疾病治療中具有重大的潛在意義。殷利眷等總結(jié)了CRISPR-Cas9 作用機(jī)制以及在病毒感染疾病治療中的應(yīng)用（詳見第412~418頁）。

人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus type 1, HIV-1)引起的人獲得性免疫缺陷綜合征(Acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)(簡(jiǎn)稱艾滋病)，是一種危害嚴(yán)重的病毒傳染性疾病。聯(lián)合國(guó)艾滋病規(guī)劃署估計(jì)，2012 年，全球約有3530萬名艾滋病患者，其中新增感染人數(shù)為230 萬人，另有160 萬人死于與艾滋病相關(guān)的疾病。盡管高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(Highly active antiretroviral therapy, HAART)提高了艾滋病患者的生活質(zhì)量，延長(zhǎng)了患者的生命。但由于HIV-1 高變異等問題，到目前為止還沒有治愈艾滋病的方法和疫苗。自HIV-1 發(fā)現(xiàn)以來，了解病毒的傳播機(jī)制、發(fā)展阻斷傳播與感染的策略是廣泛關(guān)注的焦點(diǎn)。HIV-1 在粘膜傳播過程中，病毒的遺傳多樣性顯著減少，甚至?xí)p少到一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)病毒。這些病毒會(huì)首先建立感染，并最終發(fā)展成為系統(tǒng)感染，上述病毒被稱為初始傳播病毒(Transmitted/founder virus, T/F virus)，該發(fā)現(xiàn)為闡明病毒傳播過程中嚴(yán)重的“遺傳瓶頸(Genetic bottleneck)”效應(yīng)和有限的早期進(jìn)化現(xiàn)象提供了重要的理論支撐。岑山等綜述了初始傳播病毒的發(fā)現(xiàn)、初始傳播病毒的進(jìn)化特征以及感染后初期宿主的免疫反應(yīng)等。病毒蛋白R(shí)(Vpr)是HIV-1 的輔助蛋白之一，在病毒復(fù)制過程中起重要作用（詳見第419~425頁）。

手足口病尚無上市疫苗和抗病毒藥物，主要依賴對(duì)癥治療。人腸道病毒71 血清型(Enterovirus 71, EV71)是手足口病(Hand, foot and mouth disease, HFMD)的主要病原體之一。對(duì)EV71 的分子流行病學(xué)和分子進(jìn)化研究對(duì)手足口病的監(jiān)測(cè)和防控具有重要意義。桂娟娟等總結(jié)人腸道病毒71 型基因型的分類、時(shí)空分布、進(jìn)化特征和模式以及所造成的代表性疫情，為EV71 致病機(jī)制、抗病毒藥物和疫苗的研究以及對(duì)手足口病疫情的監(jiān)測(cè)和防控提供啟發(fā)（詳見第426~435頁）。

每年新生隱球菌能夠引發(fā)致命的隱球菌病和真菌腦膜炎而死亡的超過60 萬人。新生隱球菌是進(jìn)化最為成功的環(huán)境真菌之一，在自然界中的分布極為廣泛。細(xì)胞–細(xì)胞交流、細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)換和細(xì)胞異質(zhì)性等重要環(huán)境適應(yīng)行為在協(xié)調(diào)新生隱球菌的致病性方面都扮演了重要的角色。王琳淇等從致病菌-自然棲居環(huán)境-人類宿主3方的關(guān)系解析了新生隱球菌環(huán)境適應(yīng)策略，影響毒力的機(jī)制及相關(guān)進(jìn)化動(dòng)機(jī)，并對(duì)其潛在的研究前景和臨床應(yīng)用提出了一些思考（詳見第436~441頁）。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是醫(yī)院內(nèi)獲得性感染的重要病原菌，也是社區(qū)獲得性感染中引起皮膚和軟組織等感染的主要原因。耐甲氧西林的金葡菌 (Methicillin-resistant S. aureus, MRSA)迅速傳播和蔓延至世界各個(gè)角落，成為全球感染性病原微生物。攜帶mec基因簇的葡萄球菌盒式染色體(Staphylococcal chromosome cassette mec, SCCmec)遺傳元件的獲得是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)耐藥的主要原因。饒賢才等介紹了SCCmec元件的結(jié)構(gòu)和功能，以及基于SCCmec的MRSA 分型研究（詳見第442~451頁）

萬古霉素耐藥腸球菌已逐漸發(fā)展成為重要的醫(yī)院感染病原菌。它們攜帶的萬古霉素耐藥基因簇編碼產(chǎn)物可催化合成與萬古霉素、替考拉寧等糖肽類抗生素親和力極低的細(xì)胞壁前體導(dǎo)致耐藥。徐曉剛等綜述了腸球菌中萬古霉素耐藥基因簇的類型、基因構(gòu)成及傳播特性（詳見第452~457頁）。

艱難梭菌(Clostridium difficile)是醫(yī)療保健相關(guān)性腹瀉最主要的病原菌。2002年起歐美地區(qū)艱難梭菌感染發(fā)病率和病死率均明顯增高，耐藥艱難梭菌的出現(xiàn)和傳播更給臨床治療和預(yù)防帶來了挑戰(zhàn)。絕大多數(shù)臨床分離菌對(duì)甲硝唑及萬古霉素仍呈高度敏感，但已有異質(zhì)性耐藥或最低抑菌濃度上升的報(bào)道；對(duì)紅霉素和莫西沙星等其他抗菌藥物的耐藥率在不同國(guó)家和地區(qū)則有較大差異。艱難梭菌對(duì)甲硝唑或萬古霉素敏感性下降產(chǎn)生的耐藥機(jī)制尚不明確，而對(duì)紅霉素、氟喹諾酮類、四環(huán)素和利福霉素形成的耐藥機(jī)制主要是因?yàn)樽饔冒悬c(diǎn)發(fā)生了改變。黃海輝等總結(jié)了近年來國(guó)際上艱難梭菌耐藥性及耐藥機(jī)制方面的研究進(jìn)展（詳見第458~464頁）。

我國(guó)仍然是乙型肝炎高負(fù)擔(dān)國(guó)家。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)病毒準(zhǔn)種特征與其致病特性緊密相連， HBV 病毒Core 基因區(qū)富含免疫表位，該區(qū)域的準(zhǔn)種特征直接反映病毒變異與病毒應(yīng)對(duì)宿主免疫壓力間的動(dòng)態(tài)過程。兒童與成人慢性乙型肝炎患者的臨床特征差異明顯。龍泉鑫等通過擴(kuò)增170 名兒童慢性乙型肝炎患者及121 名成人慢性乙型肝炎患者病毒Core 基因區(qū)，按照病毒基因型以及病毒e 抗原(Hepatitis B virus e antigen, HBeAg)狀態(tài)進(jìn)行分組，使用序列復(fù)雜度、多樣性、非同義突變率(Non-synonymous substitution ratio，dN)、同義突變率(Synonymous substitution ratios , dS)等指標(biāo)衡量不同組別之間的病毒準(zhǔn)種特征，從分子進(jìn)化角度揭示了兒童與成人慢性乙型肝炎病例體內(nèi)病毒Core基因區(qū)序列準(zhǔn)種差異，為兩類病人顯著不同的臨床表征提供了群體遺傳學(xué)的解釋（詳見第465~472頁）。

傷寒由傷寒沙門氏菌()引發(fā)，至今在發(fā)展中國(guó)家仍是備受關(guān)注的重要公共衛(wèi)生問題。彭哲慧等通過敲除傷寒菌脂多糖合成途徑中O-抗原連接酶基因，轉(zhuǎn)入含腦膜炎奈瑟球菌()蛋白糖基化途徑中糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)載體，以及改構(gòu)的重組銅綠假單胞菌()外毒素A(rEPAN29)的表達(dá)載體，使細(xì)胞內(nèi)能夠誘導(dǎo)合成以傷寒O 特異性多糖(O-specific polysaccharides, OPS)為目標(biāo)抗原、以rEPAN29 為載體蛋白的傷寒OPS-rEPAN29 糖蛋白復(fù)合物，并對(duì)純化所得復(fù)合物進(jìn)行了免疫原性評(píng)價(jià)。為生物法制備多糖-蛋白結(jié)合疫苗提供了新思路（詳見第473~479頁）。

研究初始傳播病毒Vpr基因遺傳變異與生物學(xué)特征對(duì)于闡明病毒建立感染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)具有重要意義。岑山等利用流式細(xì)胞術(shù)分析了C 亞型HIV-1 初始傳播病毒株與慢性感染株MJ4的Vpr蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞G2期阻滯和細(xì)胞凋亡的能力。研究發(fā)現(xiàn)：初始傳播病毒可能在病毒感染早期，通過Vpr基因的遺傳突變，提升病毒誘導(dǎo)細(xì)胞停滯G2期和細(xì)胞凋亡的能力，進(jìn)而促進(jìn)病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制和傳播（詳見第480~486頁）。

密度感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)細(xì)菌應(yīng)答反應(yīng)的發(fā)生，這些應(yīng)答反應(yīng)與細(xì)胞密度有關(guān)。與大腸桿菌()序列比較，志賀氏菌(spp.)屬密度感應(yīng)系統(tǒng)操縱子普遍存在丟失或突變。徐萍等利用哈氏弧菌()BB170 作為指示菌，證明弗氏志賀菌(可以分泌有活性的AI-2，作為密度感應(yīng)系統(tǒng)信號(hào)分子。構(gòu)建回補(bǔ)菌株和雙向電泳發(fā)現(xiàn)，密度感應(yīng)系統(tǒng)基因可以在志賀菌中表達(dá)，并鑒定到了其他一些與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的差異表達(dá)蛋白, 如Hsp60、GroEL、SodB（詳見第487~493頁）。

炭疽芽胞桿菌()、蠟樣芽胞桿菌()和蘇云金芽胞桿菌()均屬于蠟樣芽胞桿菌群，在遺傳學(xué)上有很高的相似性。PlcR(Phospholipase C regulator)在蠟樣芽胞桿菌中是十分重要的調(diào)控因子，但plcR基因在炭疽芽胞桿菌中發(fā)生一個(gè)無義突變導(dǎo)致在炭疽芽胞桿菌中產(chǎn)生一個(gè)截短PlcR蛋白。為了研究plcR基因?qū)μ烤已堪麠U菌功能的影響，賈曉琳等以蠟樣芽胞桿菌CMCC6330 基因組為模板，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pBE2A-plcR 后導(dǎo)入炭疽芽胞桿菌疫苗株A16R 中獲得重組菌株，對(duì)其進(jìn)行表型分析發(fā)現(xiàn)：將蠟樣芽胞桿菌的plcR基因?qū)胩烤已堪麠U菌后，可以直接激活神經(jīng)鞘磷脂酶活性（詳見第494~498頁）。