郭 　航，　張 天 任，　孫 　興，　黃 忠 剛，　肖 　珊，　王 　晗，　王 際 輝

( 1.大連工業(yè)大學 食品學院, 遼寧 大連　116034；

2.大連博仕奧生物科技有限公司， 遼寧 大連　116085 )

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海藻酸降解菌的篩選及其在刺參發(fā)酵餌料制備中的應用

郭 航1，張 天 任1，孫 興1，黃 忠 剛2，肖 珊1，王 晗1，王 際 輝1

( 1.大連工業(yè)大學 食品學院, 遼寧 大連116034；

2.大連博仕奧生物科技有限公司， 遼寧 大連116085 )

摘要:從穿孔海帶中篩選出一株能降解海藻中海藻膠且對刺參無致病性的細菌D。經(jīng)16S rDNA鑒定，該菌株為假交替單胞菌。將該株假單胞菌與實驗室保藏的EM菌混合后對海參餌料進行固態(tài)發(fā)酵,接種量為3%，接種比例為褐藻酸降解菌與EM菌的體積比為1∶2，含水量45%，溫度28 ℃，發(fā)酵周期為5 d，并對發(fā)酵后的餌料品質進行評價。結果表明，發(fā)酵餌料氣味更鮮香。通過發(fā)酵，餌料粗蛋白及還原糖的質量分數(shù)分別增加了11.40%和136.31%，粗纖維、粗灰分及褐藻酸的質量分數(shù)分別降低了13.17%，16.20%及32.50%。

關鍵詞:褐藻酸降解菌；刺參；發(fā)酵餌料；固態(tài)發(fā)酵

Screening of alginate degrading bacteria and its application

0引言

刺參(Apostichopusjaponicas)富含豐富的膠原蛋白和多聚糖，并且含有鈣、鐵、錳等多種微量元素，具有較高的食用和藥用價值，是我國北方重要的海產(chǎn)經(jīng)濟動物之一。隨著刺參養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，復合餌料等相關行業(yè)也隨之發(fā)展。然而，目前海參營養(yǎng)需求方面的研究還不成熟，缺乏相關的標準，海參餌料也呈現(xiàn)出營養(yǎng)不全面，消化吸收利用率低等現(xiàn)象[1]。

王吉橋等[2]研究刺參腸道酶活時發(fā)現(xiàn)刺參腸道中褐藻酸酶及纖維素酶活力較低。然而刺參餌料的主要成分為富含褐藻酸和纖維素的藻類[3]。研究表明，適量的益生菌能夠提高水產(chǎn)動物的生長率及消化酶活力[4-5]。因此，可以通過餌料發(fā)酵以提高利用率，在發(fā)酵過程中，益生菌迅速繁殖并成為優(yōu)勢菌群，能夠抑制有害菌、致病菌的生長，從而降低刺參的發(fā)病率，提高其成活率。益生菌發(fā)酵可以將餌料中的大分子蛋白質降解為多肽、小肽及游離氨基酸，除去多種抗營養(yǎng)因子，提高餌料消化吸收率[6]。發(fā)酵餌料中富含的活性菌體還能起到凈化水質的作用，枯草芽孢桿菌、光合細菌及乳酸菌等能夠有效降低刺參養(yǎng)殖水體中的氨氮、亞硝酸鹽及硫化氫水平[7-9]。因此，發(fā)酵餌料還有可能對刺參池塘養(yǎng)殖倒池周期的延長做出貢獻。與液體發(fā)酵相比，采用固態(tài)發(fā)酵的方式在很大程度上降低了發(fā)酵餌料的含水量，使餌料便于貯存和運輸，對發(fā)酵餌料的大規(guī)模生產(chǎn)和推廣具有重要的經(jīng)濟價值和現(xiàn)實意義[10]。

本實驗從海洋環(huán)境中篩選出能夠降解褐藻酸和纖維素等大分子物質的益生菌，并與實驗室保藏的EM菌混合，對刺參餌料進行固態(tài)發(fā)酵，以改善餌料的適口性，提高餌料的利用率，以期為刺參復合營養(yǎng)餌料的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種來源

從大連渤海灣野生刺參腸道、鮑魚腸道及穿孔海帶中分離篩選褐藻酸降解菌；EM菌(枯草芽孢桿菌、釀酒酵母和植物乳桿菌)為實驗室保藏菌株。

1.1.2培養(yǎng)基

(1)初篩培養(yǎng)基：海藻酸鈉0.5%，(NH4)2SO40.5%，K2HPO40.2%，MgSO4·7H2O 0.2%，NaCl 2.5%，瓊脂1.3%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01%；pH 7.5[11]。

(2)復篩培養(yǎng)基

液體種子：蛋白胨0.5%，酵母提取物0.1%，海藻酸鈉0.5%，NaCl 3%；pH 7.5。

搖瓶復篩培養(yǎng)基：海藻酸鈉0.5%，(NH4)SO40.5%，K2HPO40.2%，MgSO4·7H2O 0.2%，NaCl 2.5%；pH 7.5[12]。

(3)EM菌培養(yǎng)基

乳酸菌液體種子培養(yǎng)基：牛肉膏1%，蛋白胨1%，酵母膏0.4%，葡萄糖2%，蔗糖1%，乙酸鈉0.5%，檸檬酸銨0.2%，K2HPO40.08%，MgSO4·7H2O 0.02%，MnSO40.005%，輕質碳酸鈣0.1%，吐溫80 1 mL；pH 6.2。

芽孢桿菌液體種子培養(yǎng)基：牛肉膏1%，蛋白胨1%，葡萄糖1%，NaCl 0.5%；pH 7.0～7.2。

酵母菌液體種子培養(yǎng)基：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%；自然pH。

(4)發(fā)酵培養(yǎng)基：黃腐酸0.5%，酵母膏0.64%，尿素0.18%，味精0.09%，NaCl 0.09%，香菇粉0.125%，KH2PO40.31%，輕質CaCO31.5%，紅糖5.6%；自然pH。

1.2菌株的分離篩選

1.2.1平板初篩

將從海底取回的新鮮刺參、鮑魚用無菌解剖法取出腸道內容物，并將取回的穿孔海帶切碎，將腸道內容物和海帶于低溫條件下(4 ℃)勻漿，并用滅菌海水按10-1～10-6濃度梯度稀釋[13]。取0.1 mL稀釋液涂布于初篩培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)2～5 d，挑取降解圈明顯不同的菌落進行編號，記錄菌落顏色、狀態(tài)、降解圈大小。分離純化后，挑至斜面培養(yǎng)基保藏。

1.2.2復篩

將初篩的菌種接入50 mL種子培養(yǎng)基中，25 ℃、150 r/min培養(yǎng)20 h；取對數(shù)生長期的種子液以2%的接種量接種到100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h；最后在4 ℃、8 000 r/min 條件下離心20 min，取上清，按照湯海青[14]的方法測定酶活，并測定生長曲線。

1.2.3安全性試驗

取80只個體大小相近的健康刺參(800頭)，分成4組(空白、B、D、S)，于玻璃缸中喂養(yǎng)，玻璃缸裝水量為9 L，每2 d換一次海水，換水量為1/2，日投餌量為刺參體重的3%。馴化一周后，每組投5×109cfu/mL菌液，空白對照組加入等量的海水，每日觀察記錄刺參健康狀況，并計算存活率，實驗周期為10 d。

1.2.4菌株的鑒定

將純化好的菌種送至大連華大基因研究中心進行菌種鑒定。16S rDNA測序結果使用NCBI的Blast軟件與Gene Bank數(shù)據(jù)庫中的已知種類微生物的16S rDNA基因序列進行比對，得到相似度最高的序列，并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3發(fā)酵餌料的制備

1.3.1餌料配方

脫膠海帶粉32%，馬尾藻粉20%，海青粉20%，玉米粉6%，破壁酵母粉5%，發(fā)酵豆粕4%，蝦粉4%，預混料4%，魚粉3%，扇貝邊粉2%，紅糖1%。

1.3.2發(fā)酵條件

設置對照組和試驗組2個處理組，對照組為未發(fā)酵的餌料，試驗組為EM菌混合褐藻酸降解菌發(fā)酵組，EM菌及褐藻酸降解菌的添加量分別為每10 kg干料添加200和100 mL菌液，調整水分質量分數(shù)為40%～45%。密封裝袋后于室溫發(fā)酵，根據(jù)外界溫度的不同發(fā)酵天數(shù)為5～7 d。

1.4發(fā)酵餌料的品質評價

1.4.1感官評價

對發(fā)酵餌料進行取樣、觀察、記錄，對比發(fā)酵前后餌料的顏色、氣味、黏度及對刺參的誘食效果。

1.4.2理化指標測定

粗蛋白的測定采用凱氏定氮法，具體方法參見GB/T 6432—1994《飼料中粗蛋白的測定方法》；粗纖維的測定采用快速測定法[15]；粗灰分的測定采用灼燒法，具體方法參見GB/T 6438—2007；還原糖的測定采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法[16]；褐藻膠含量測定采用醋酸鈣法[17]；以上實驗每組設置3個平行。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用SPSS Statistics 20.0統(tǒng)計分析軟件對實驗各處理組進行Anova分析(P<0.05)。

2結果與討論

2.1菌種的分離篩選

2.1.1菌株篩選

根據(jù)菌落形態(tài)及其在初篩培養(yǎng)基表面形成的降解圈大小，在3個樣品中共篩選出24株具有褐藻酸降解能力的菌株。經(jīng)過復篩篩選出褐藻膠降解效果好并且性狀穩(wěn)定的3種菌株B，D，S。

2.1.2安全性試驗

投菌12 h后，B菌試驗組刺參全部沉底，不再貼壁生長。刺參出現(xiàn)搖頭、腐皮現(xiàn)象，其余3組刺參生長狀況良好。36 h后，B菌試驗組有部分海參出現(xiàn)自溶；S菌試驗組有一只海參死亡，對照組及D菌試驗組刺參生長狀況均良好。養(yǎng)殖10 d 后，對照組、B菌組、D菌組及S菌組刺參存活率分別為95%，20%，95%及90%，因此淘汰B菌株和S菌株。在養(yǎng)殖試驗期間還發(fā)現(xiàn)，D菌組的水質比對照組澄清，說明篩選出的菌株可以降解掉池底殘餌中多余的褐藻膠，對養(yǎng)殖水體水質起到一定的改善作用。

2.1.3生長曲線及褐藻酸酶活測定

對D菌進行生長曲線測定，結果如圖1所示，D菌的調整期比較短，2～18 h為對數(shù)生長期，穩(wěn)定期較長，說明可以長時間的保持菌種活力。酶活為0.933 U/mL，比湯海青[14]、武玉勇[18]等的測定值小，因而在后續(xù)實驗中進一步優(yōu)化D菌的產(chǎn)酶條件以達到更佳酶活。

2.1.416S rDNA分析結果

D菌株的16S rDNA基因測序結果表明，該菌的16S基因大小為1 285 Da。根據(jù)Blast軟件分析，與該序列相似度大于99%的序列來自于Pseudoalteromonas種屬的細菌，該序列與Pseudoalteromonas_sp._UST041101-043序列的相似度最高，最大匹配度為44%，因此該菌株被鑒定為Pseudoalteromonas.sp。Pseudoalteromonas屬系統(tǒng)進化樹見圖1。Pseudoalteromonas菌種特征：海洋細菌，短桿狀，乳白色，菌落表面濕滑，革蘭陰性菌(G-)，好氧。

圖1　D菌的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2發(fā)酵餌料品質評價

2.2.1感官評價

餌料感官評價結果見表1。未發(fā)酵餌料呈土黃色，發(fā)酵餌料顏色發(fā)生變化，趨近于海泥的顏色；氣味上，未發(fā)酵餌料帶有海藻的腥味，而發(fā)酵料由于乳酸菌在代謝過程中產(chǎn)生了乳酸，不僅可以降低pH抑制有害微生物生長，而且使餌料呈現(xiàn)乳酸的酸香味，與姜燕等[10]發(fā)酵的海參餌料效果一致。發(fā)酵過程中，芳香類物質的產(chǎn)生使餌料同時具有海鮮的鮮香味；餌料發(fā)酵后，黏度增加，能與海泥更好地混合，將餌料投喂海參，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵餌料對海參的誘食性更強。

表1　餌料的感官評價

2.2.2理化指標評價

以粗蛋白、粗纖維、粗灰分、還原糖及褐藻酸為指標的理化評價見表2。

2.2.2.1粗蛋白

由于發(fā)酵體系中加入活菌，菌體在適宜的載體中大量繁殖，利用環(huán)境中的營養(yǎng)物質在體內產(chǎn)生一些必需的蛋白質及氨基酸類的代謝產(chǎn)物，使餌料粗蛋白含量有所增加。從表2中可以看出，發(fā)酵餌料的粗蛋白質量分數(shù)為20.32%，比未發(fā)酵餌料提高了11.40%。發(fā)酵后的刺參餌料的蛋白含量符合朱偉等[19]研究的刺參的增重率范圍。王吉橋等[20]研究表明，刺參在養(yǎng)殖高溫期對蛋白質的需求量增加，因此可以通過發(fā)酵的方式提高餌料中的蛋白質含量，從而減少餌料蛋白質的補充。

表2　餌料的理化指標評價

2.2.2.2粗纖維

發(fā)酵餌料粗纖維質量分數(shù)為18.59%，比未發(fā)酵組降低了13.17%。馬尾藻、海帶及豆粕中都含有刺參不容易消化的纖維素，芽孢桿菌、乳酸菌等代謝產(chǎn)生的纖維素酶可以有效降解餌料中難以消化的纖維素，使餌料更容易消化分解，提高餌料的營養(yǎng)價值[21]。

2.2.2.3粗灰分

發(fā)酵組粗灰分質量分數(shù)為33.22%，比未發(fā)酵組降低了16.20%。這可能是由于發(fā)酵體系中含有大量的微生物，可以通過自身代謝作用將餌料中的部分無機物轉化為可以被刺參利用的有機物，提高了餌料的利用率。餌料中存在的大量活菌還可以起到降低養(yǎng)殖水體富營養(yǎng)化，減少底泥腐敗和環(huán)境污染的作用。

2.2.2.4還原糖

發(fā)酵過程顯著地提高了海參餌料的還原糖含量，發(fā)酵組還原糖質量分數(shù)為4.23%，比未發(fā)酵料增長了1.36倍。這可能是由于芽孢桿菌及乳酸菌能產(chǎn)纖維素酶、淀粉酶、果膠酶等多種酶類，這些酶作用于餌料中含有纖維素、淀粉、碳水化合物的海藻、豆粕，將其細胞壁分解為非結構性碳水化合物，還原糖量增加[22]。同時酵母菌也能分泌胞外酶將非還原糖轉化為還原糖[23]，并且產(chǎn)生乙醇，這也是發(fā)酵餌料酒香氣味的來源。還原糖含量的增加可以改善餌料的適口性，增加其對刺參的誘食性。

2.2.2.5褐藻酸

發(fā)酵組褐藻酸質量分數(shù)為8.95%，比未發(fā)酵料降低了32.5%。海帶及海藻等大型藻類中含有高黏度且不易被刺參消化吸收的褐藻酸及多糖，褐藻酸降解菌產(chǎn)生的褐藻酸裂解酶能有效降解褐藻酸并生成小分子活性寡糖，更有利于刺參消化吸收，提高餌料的利用率[24-25]。此外，由于餌料發(fā)酵后海藻酸含量降低，可以在餌料中增加海帶的比例來替代部分價格昂貴的馬尾藻，達到節(jié)約企業(yè)成本的目的。

3結論

本研究用從穿孔海帶中篩選出一株能降解海藻褐藻膠的菌株D，經(jīng)16S rDNA鑒定，該菌株為假交替單胞菌。安全性試驗表明，菌液濃度到達5×109cfu/mL時對刺參無致病性，可用其發(fā)酵刺參餌料，產(chǎn)褐藻酸酶活力為0.933 U/mL。

與普通的未發(fā)酵餌料相比，用含有褐藻酸降解菌的EM菌發(fā)酵的刺參餌料能減少餌料的腥味，氣味更好。發(fā)酵后的餌料粗蛋白及還原糖質量分數(shù)分別增加了11.40%和136.31%，粗纖維、粗灰分及褐藻酸質量分數(shù)分別降低了13.17%，16.20%及32.50%。

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in fermented feed for sea cucumberApostichopusjaponicas

GUOHang1,ZHANGTianren1,SUNXing1,HUANGZhonggang2,

XIAOShan1,WANGHan1,WANGJihui1

( 1.School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；

2.Dalian Boss-all Biological Science and Technology Limited Company, Dalian 116085, China )

Abstract:An align-degrading bacteria D was isolated and purified from perforated kelp, which was non-pathogenic for sea cucumber. The strain was Pseudoalteromonas identified by 16S rDNA. Apostichopus japonicas baits were fermented with bacteria D and EM bacteria, which inoculum size was 3%; volume proportion of bacteria D and EM bacteria was 1∶2; moisture was 45%; temperature was 28 ℃; fermented time was 5 d, and qualities of bait were evaluated after fermented. The results showed that the fermented feed’s flavor was more delicious and attractive for Apostichopus japonicas. The mass fraction of crude protein and reducing sugar were increased by 11.40% and 136.31% respectively, while crude fiber, crude ash and alginate were reduced to 13.17%, 16.20% and 32.50% respectively.

Key words:alginate degrading bacteria; Apostichopus japonicas; fermented bait; solid-state fermentation

文章編號:1674-1404(2015)06-0396-05

通信作者：

作者簡介:郭 航(1989-)，女，碩士研究生；王際輝(1970-)，男，教授.

基金項目:國家海洋公益性行業(yè)科研專項項目(201405003)；國家海洋食品工程技術研究中心資助(2012FU125X03)；遼寧省教育廳創(chuàng)新團隊項目(LT2014010)；遼寧省科技計劃項目(2014211003)；遼寧省高等學校重大科技平臺項目(2011191).

收稿日期:2014-12-19.

中圖分類號:TS201.3；Q815

文獻標志碼:A