林 　 迪，　金 鳳 燮，　魚 紅 閃

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連　116034 )

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白頭翁皂苷H3糖苷酶的分離純化及酶性質(zhì)

林 迪，金 鳳 燮，魚 紅 閃

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連116034 )

摘要:對Absidia sp.P39r所產(chǎn)白頭翁皂苷H3糖苷酶進(jìn)行了分離純化，得到了電泳純的酶蛋白，并對其性質(zhì)做了進(jìn)一步研究。結(jié)果表明，該酶分子質(zhì)量約為40 ku；最適反應(yīng)溫度為40 ℃，最適反應(yīng)pH為5.0；在pH 4.0～7.0，溫度低于40 ℃條件下具有相對穩(wěn)定的酶活力；金屬離子Na+、K+、Mg2+對酶反應(yīng)無顯著影響，而Fe3+、Cu2+、Zn2+對其有較強(qiáng)的抑制作用；米氏常數(shù)為17.01 mmol/L，最大反應(yīng)速度為0.38 mmol/(L·min)。

關(guān)鍵詞:白頭翁皂苷；糖苷酶；酶性質(zhì)

0引言

白頭翁皂苷是白頭翁干燥根重要的活性成分，質(zhì)量分?jǐn)?shù)在8%～10%[1]，大部分為多糖基皂苷，需要轉(zhuǎn)化為低糖基皂苷才可被人體吸收[2]。這種轉(zhuǎn)化通常是在人體腸道中由腸道菌群完成。如果能將這一轉(zhuǎn)化在人體外完成，不僅能提高皂苷的生物活性，利用率也能得到顯著提升[3]。

白頭翁皂苷H3是具有6個糖基的多糖基皂苷[4]。目前，對白頭翁皂苷的研究主要集中在白頭翁皂苷的分離純化及其藥理作用等方面[5-6]，對白頭翁皂苷的糖苷酶研究較少。本實(shí)驗(yàn)室前期在白頭翁皂苷的分離純化以及生物轉(zhuǎn)化方面做了一定工作，制備出了高純度的白頭翁皂苷H3；在皂苷糖苷酶方面，發(fā)現(xiàn)了對白頭翁皂苷有明顯水解作用的糖苷酶，但該酶對白頭翁皂苷H3水解效果并不明顯[7-8]。本實(shí)驗(yàn)室對具有白頭翁皂苷H3水解能力的酶進(jìn)行了重新篩選，從Absidiasp. P39r菌株中得到一種酶，該酶對白頭翁皂苷H3有較強(qiáng)的水解能力，能將其水解為更利于人體吸收的低糖基皂苷，暫時(shí)將該酶命名為白頭翁皂苷H3糖基水解酶。對白頭翁皂苷H3糖苷酶分離純化并研究其酶學(xué)性質(zhì)。

1材料與方法

1.1材料

菌種：Absidiasp.P39r，大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院保藏；白頭翁皂苷H3，實(shí)驗(yàn)室制備；低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，北京索萊寶科技有限公司。

HDL-組合式紫外檢測儀，上海金達(dá)生化儀器有限公司；JM-250蛋白電泳儀，大連捷邁科貿(mào)有限公司。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基

白頭翁粉100 g，加水500 mL，水浴8 h(水浴過程中注意補(bǔ)水)。過濾、離心，得到的上清液補(bǔ)水至300 mL備用。將6°麥汁同制備好的白頭翁浸出液按4∶1混勻，制成白頭翁皂苷H3糖苷酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基，備用。

1.2.2菌株的發(fā)酵及粗酶液的提取

將Absidiasp.P39r接種到滅菌過的發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后將接好菌的培養(yǎng)基置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，培養(yǎng)條件為30 ℃，150 r/min。

酶的提取方法參照文獻(xiàn)[9]。收集得到的蛋白沉淀，用20 mmol/L的pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液溶解，透析24 h。將透析液離心10 min，離心條件為4 ℃、8 000 r/min。得到的上清液即為粗酶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3酶的分離純化

采用DEAE-Cellulose DE52陰離子交換柱(Φ2 cm×12 cm)對粗酶液進(jìn)行分離純化。將粗酶液加入到離子交換柱中，上樣量為10 mL，待粗酶液完全吸附后，先用緩沖液洗脫，再分別用60，90，120，150，180 mmol/L的KCl溶液進(jìn)行梯度洗脫；其中KCl溶液以20 mmol/L的pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液配制。洗脫液在280 nm紫外光下測定吸光度，檢測后的洗脫液利用自動分部收集器收集。

1.2.4蛋白質(zhì)含量的測定

用Folin-酚法測定溶液中蛋白質(zhì)含量。

1.2.5酶蛋白分子質(zhì)量的測定

采用SDS-PAGE法測定提純酶的純度及分子質(zhì)量。標(biāo)準(zhǔn)蛋白為磷酸酶b(97.4 ku)、牛血清蛋白(66.2 ku)、肌動蛋白(43 ku)、碳酸酐酶(31 ku)、胰蛋白酶抑制劑(22 ku)、溶菌酶(14.4 ku)。

1.2.6酶活力的測定

用TLC法檢測酶活力。將白頭翁皂苷H3制成2 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為酶反應(yīng)的底物，溶劑為20 mmol/L的pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液。將白頭翁皂苷H3溶液與酶液按照體積比1∶1 充分混合，40 ℃條件下反應(yīng)24 h，加入2倍體積水飽和正丁醇終止反應(yīng)，振蕩，離心，取上層液體作為TLC檢測的樣品，展開劑氯仿-甲醇-水體積比為6.5∶4∶0.5，10%硫酸顯色。通過Bandscan分析酶反應(yīng)產(chǎn)物含量。酶活力定義為：在40 ℃條件下，每小時(shí)水解1 μmol白頭翁皂苷H3所需的酶量為一個酶活力單位。

2結(jié)果與討論

2.1粗酶的純化及其分子質(zhì)量的測定

按“1.2.3”的方法對粗酶液進(jìn)行分離純化，各純化步驟結(jié)果如表1所示。

表1　白頭翁皂苷H3糖苷酶純化結(jié)果

對DEAE-DE52得到的酶液進(jìn)行純度及分子質(zhì)量測定結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，62號管為目標(biāo)單帶。測定62號管酶液的酶活力，發(fā)現(xiàn)其對白頭翁皂苷H3具有較強(qiáng)的水解能力。由此可認(rèn)定第62管為電泳純的白頭翁皂苷H3糖苷酶。根據(jù)圖1得到回歸方程：lgY=2.086 0-1.030 7X。計(jì)算出其分子質(zhì)量約為40 ku。

圖1　純化樣品的SDS-PAGE圖

2.2酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1pH對酶反應(yīng)的影響

將提純的酶置于pH 2.0～9.0緩沖體系中，于4 ℃下保存24 h，相對酶活力結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，當(dāng)pH為5.0時(shí)，白頭翁皂苷H3糖苷酶的酶活力達(dá)到最大；pH在4.0～7.0時(shí)，相對酶活力較高，且酶活穩(wěn)定。

2.2.2溫度對酶反應(yīng)的影響

由圖3可以看出，隨著溫度的升高，該酶的相對酶活力隨之升高，當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，酶活力達(dá)到最高；當(dāng)溫度超過40 ℃，隨著溫度的升高，其相對酶活力反而隨之下降。因此，該酶的最適反應(yīng)溫度為40 ℃，在40 ℃下酶活穩(wěn)定。

圖2　最適pH及pH穩(wěn)定性曲線

圖3　最適溫度及溫度穩(wěn)定性曲線

2.2.3金屬離子對酶反應(yīng)的影響

向反應(yīng)體系中加入不同濃度的金屬離子，以檢測金屬離子對白頭翁皂苷H3糖苷酶酶活力的影響，結(jié)果見表2。其中K+、Mg2+、Na+對酶反應(yīng)基本沒有影響；而Fe3+、Cu2+、Zn2+隨著離子濃度的增大，對酶反應(yīng)的抑制作用明顯增強(qiáng)。

表2　金屬離子對酶活力的影響

2.2.4反應(yīng)動力學(xué)

配制濃度為8，10，12，16，25 mmol/L的白頭翁皂苷溶液，與等體積的酶液混合，在pH 5.0條件，40 ℃下反應(yīng)1 h，根據(jù)米氏方程：1/V=2.64+44.88/S，計(jì)算得到米氏常數(shù)Km=17.01 mmol/L，最大反應(yīng)速度Vmax=0.38 mmol/(L·min)。

3結(jié)論

通過對Absidiasp.P39r菌株發(fā)酵得到的粗酶液的分離純化，得到較純的白頭翁皂苷H3糖苷酶。確定了該酶的分子質(zhì)量為40 ku。對純酶做進(jìn)一步的酶性質(zhì)研究，得到該酶的最適反應(yīng)pH為5.0，最適反應(yīng)溫度為40 ℃。該酶在pH 4.0～7.0，溫度低于40 ℃條件下酶活力相對穩(wěn)定。金屬離子K+、Mg2+、Na+對酶反應(yīng)無顯著影響；而Fe3+、Cu2+、Zn2+對其有較強(qiáng)的抑制作用。根據(jù)反應(yīng)動力學(xué)方程得到米氏常數(shù)Km=17.01 mmol/L，Vmax=0.38 mmol/(L·min)。

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Isolation and properties of pulchinenoside H3 glycosidase

LINDi,JINFengxie,YUHongshan

( School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

Abstract:Glycosidase capable of degrading pulchinenoside H3 from Absidia sp.P39r was purified and characterized. The results showed that its molecular weight was 40 ku, and the maximal activity was obtained at pH 5 and 40 ℃ and stable at pH 4.0-7.0 and 40 ℃. Ions of Fe3+, Cu2+, Zn2+inhibit glycosidase but Na+, K+, Mg2+had no effect on the activity. The maximum reaction rate was 0.38 mmol/(L·min) and Kspanwas 17.01 mmol/L.

Key words:pulchinenoside; glycosidase; enzymatic characteristics

文章編號:1674-1404(2015)06-0404-04

通信作者：

作者簡介:林 迪(1991-)，男，碩士研究生；魚紅閃(1968-)，男，教授.

基金項(xiàng)目:“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(2012ZX09503001-003).

收稿日期:2014-12-16.

中圖分類號:TS201.2；Q556.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A