潘 苗 苗，　楊 雨 迎，　張 　 健，　金 朝 霞，　張 孟 夏，　張 宗 申

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連　116034 )

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草酸對(duì)金鐵鎖懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的影響

潘 苗 苗，楊 雨 迎，張 健，金 朝 霞，張 孟 夏，張 宗 申

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連116034 )

摘要:研究了黑暗和光照下草酸對(duì)金鐵鎖懸浮細(xì)胞的生理影響。結(jié)果表明，外源草酸會(huì)導(dǎo)致金鐵鎖懸浮細(xì)胞膜透性增加，變化幅度與使用的草酸濃度有關(guān)系；草酸處理還會(huì)引起懸浮細(xì)胞中過氧化氫酶(CAT)活性和皂苷含量的增加，0.1 mmol/L草酸是最佳誘導(dǎo)濃度。對(duì)金鐵鎖懸浮細(xì)胞提供光照(3 000 lx)，可以長時(shí)間保持細(xì)胞中CAT活性并有利于皂苷積累。草酸具有一定的促進(jìn)金鐵鎖懸浮細(xì)胞積累皂苷的作用，一定的光照有利于草酸的誘導(dǎo)作用。

關(guān)鍵詞:金鐵鎖；懸浮細(xì)胞；草酸；光培養(yǎng)

0引言

金鐵鎖屬于石竹科(Caryophyllaceae)金鐵鎖屬(Psammosilene)，為單屬單種的多年生草本植物，其根是“云南白藥”等多個(gè)著名中成藥的主要原料。主要化學(xué)成分包括三萜皂苷、環(huán)肽及內(nèi)酰胺等，其中起鎮(zhèn)痛和抑菌作用的成分是皂苷類物質(zhì)[1]。由于金鐵鎖在自然條件下生長周期長(3～4年)，以及環(huán)境惡化和市場(chǎng)需求增加等原因，金鐵鎖野生資源數(shù)量急劇下降，成為《中國植物紅皮書》中的國家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)的珍稀瀕危物種[2-3]。利用細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)生產(chǎn)金鐵鎖天然產(chǎn)物，具有不受季節(jié)、土地和環(huán)境等因素限制的優(yōu)勢(shì)，是解決金鐵鎖藥用資源匱乏問題的途徑之一。

研究表明，草酸是一種有效的非生物誘導(dǎo)子，可以改變植物細(xì)胞的生理生化代謝和細(xì)胞生長發(fā)育狀態(tài)，提高植物細(xì)胞的抗逆性[4]。張健等[5]發(fā)現(xiàn)草酸處理金鐵鎖懸浮細(xì)胞能夠引起胞內(nèi)過氧化物酶活性和細(xì)胞壁木質(zhì)素沉積的改變。草酸還可能通過啟動(dòng)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)和激活關(guān)鍵酶的活性等機(jī)制促進(jìn)丹參、人參及南方紅豆杉等細(xì)胞中的次生代謝產(chǎn)物積累[6-7]。

光作為影響植物生長和發(fā)育的重要環(huán)境因子之一,在植物的形態(tài)建成和發(fā)育分化過程中起著重要的作用。陳順欽等[8]發(fā)現(xiàn)光照可以刺激黃芩相關(guān)基因的表達(dá)從而提高黃芩有效成分的含量。本實(shí)驗(yàn)研究了黑暗和光照條件下草酸處理對(duì)金鐵鎖懸浮細(xì)胞的影響，探討光在草酸誘導(dǎo)金鐵鎖懸浮細(xì)胞變化過程中的作用，為揭示草酸-植物細(xì)胞互作機(jī)理、篩選高效誘導(dǎo)子以及優(yōu)化金鐵鎖懸浮細(xì)胞培養(yǎng)工藝提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

在無菌條件下，挑選質(zhì)地疏松、淡黃色或乳白色的金鐵鎖愈傷組織，按照愈傷組織質(zhì)量與培養(yǎng)液體積1∶10(g/mL)建立MS液體培養(yǎng)體系，在25 ℃、110 r/min搖床中暗培養(yǎng)[5]。

1.2方法

1.2.1外源草酸的處理

取一定體積的草酸溶液(0.1 mol/L)，用NaOH調(diào)至pH 5.9，加入液體培養(yǎng)基中，滅菌。將細(xì)胞繼代于不同濃度草酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞活力測(cè)定

使用TTC染色法測(cè)定細(xì)胞活力[5]。

1.2.3細(xì)胞膜滲透率的測(cè)定

采用電導(dǎo)率法測(cè)定細(xì)胞膜滲透率。將相同的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞均分成2份，分別加入等體積的培養(yǎng)液L0(原培養(yǎng)液)與L1(含草酸)，經(jīng)相同時(shí)間處理后測(cè)定電導(dǎo)率，分別為C0和C1。將L1用保鮮膜封口，沸水浴3 min后冷卻至室溫，測(cè)定其電導(dǎo)率為Ct。按照公式η=(C1-C0)/(Ct-C0)計(jì)算草酸處理后引起的細(xì)胞膜滲透率變化[9]。

1.2.4細(xì)胞中過氧化氫酶(CAT)活力測(cè)定

取0.1 g鮮細(xì)胞，用3 mL磷酸緩沖液(50 mmol/L，pH 7.8)懸浮后添加1 mL 0.1 mol/L H2O2溶液，立即計(jì)時(shí)，每分鐘測(cè)定一次λ240處的吸光度，共測(cè)3次，分別為A1、A2、A3。將細(xì)胞沸水浴處理10 min后重復(fù)操作，測(cè)得結(jié)果為A0作為對(duì)照[10]。以ΔA240表示CAT活力變化，計(jì)算公式為：ΔA240=A0-(A1+A2+A3)/3。

1.2.5金鐵鎖皂苷的提取及測(cè)定

將金鐵鎖懸浮細(xì)胞樣品離心，去除培養(yǎng)液，以去離子水洗滌細(xì)胞3次，干燥，稱重，75%乙醇回流提取3次，合并提取液，過濾，濾液蒸干得到干膏，加2倍體積水溶解干膏，然后用等體積石油醚萃取3次，保留水層，再用等體積水飽和正丁醇萃取3次，保留正丁醇層，蒸發(fā)至干膏，減壓干燥至恒重，即得到金鐵鎖粗總皂苷。本實(shí)驗(yàn)選擇人參皂苷Re為對(duì)照品,采用香草醛-高氯酸比色法測(cè)定金鐵鎖總苷含量[11]。

2結(jié)果與結(jié)論

2.1草酸對(duì)懸浮細(xì)胞膜透性的影響

2.1.1草酸濃度對(duì)細(xì)胞膜滲透率的影響

在暗培養(yǎng)條件下，用不同濃度草酸(0.5，1，5，10，15，20，25和30 mmol/L)處理金鐵鎖懸浮細(xì)胞8 h后，測(cè)定細(xì)胞膜滲透率，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，草酸濃度低于1 mmol/L時(shí)，細(xì)胞膜滲透率變化不明顯；當(dāng)草酸濃度高于5 mmol/L 時(shí)，細(xì)胞膜滲透率明顯增加；當(dāng)草酸濃度達(dá)到20 mmol/L時(shí)，細(xì)胞膜滲透率達(dá)到65%，繼續(xù)提高草酸濃度細(xì)胞膜滲透率增幅不大。

圖1草酸濃度對(duì)金鐵鎖懸浮細(xì)胞膜透性的影響

Fig.1EffectsofoxalicacidconcentrationonthemembranepermeabilityofP. tunicoidessuspensioncells

細(xì)胞膜是胞內(nèi)外物質(zhì)交換的界膜，其完整性對(duì)維持細(xì)胞的正常生理活動(dòng)具有重要意義。因此，本實(shí)驗(yàn)利用細(xì)胞膜透性的變化作為生理評(píng)價(jià)指標(biāo)，反映草酸對(duì)金鐵鎖懸浮細(xì)胞膜的影響。當(dāng)草酸濃度為5mmol/L以上時(shí)，細(xì)胞膜滲透率開始增大，說明草酸開始改變細(xì)胞膜半透性，引起胞內(nèi)離子外滲；當(dāng)草酸濃度達(dá)到20mmol/L以上，電導(dǎo)率急劇升高，表明電解質(zhì)大量釋放到胞外，細(xì)胞膜的完整性受到嚴(yán)重影響。因此，在金鐵鎖懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中,草酸作為誘導(dǎo)因子的使用濃度不應(yīng)超過5mmol/L。

2.1.2草酸處理時(shí)間對(duì)細(xì)胞膜滲透率的影響

在暗培養(yǎng)條件下，選擇不同濃度的草酸處理金鐵鎖懸浮細(xì)胞，每隔4h測(cè)一次懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基的電導(dǎo)率，觀察膜透性與草酸處理時(shí)間的關(guān)系。根據(jù)“2.1.1”的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別選取草酸處理濃度為1和5mmol/L，測(cè)定2種濃度在不同處理時(shí)間后的細(xì)胞滲透率變化，結(jié)果如圖2所示。

圖2草酸處理時(shí)間對(duì)金鐵鎖懸浮細(xì)胞膜透性的影響

Fig.2EffectsofprocessingtimeofoxalicacidonthemembranepermeabilityofP. tunicoidessuspensionculturedcells

由圖2可以看出，兩種濃度草酸處理后，細(xì)胞膜滲透率都是隨時(shí)間延長而增加，其中1mmol/L草酸處理后，細(xì)胞膜滲透率28h后保持穩(wěn)定；5mmol/L草酸處理的細(xì)胞膜滲透率在16h時(shí)就達(dá)到最大值。該結(jié)果表明草酸對(duì)懸浮細(xì)胞膜透性的影響，具有濃度和時(shí)間依賴性。

2.2草酸對(duì)懸浮細(xì)胞CAT活性的影響

2.2.1草酸濃度對(duì)懸浮細(xì)胞CAT活性的影響

在暗培養(yǎng)條件下，用不同濃度的草酸(0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.5，0.6，0.8和1.0mmol/L)處理金鐵鎖懸浮細(xì)胞16h后，測(cè)定細(xì)胞中CAT活性和細(xì)胞活力變化，結(jié)果如圖3所示。草酸濃度在0～0.2mmol/L時(shí)，CAT活性顯著增加，且細(xì)胞活力逐漸增強(qiáng)， 0.2mmol/L草酸處理的細(xì)胞活力較對(duì)照增加46.08%；當(dāng)草酸濃度在0.2～0.5mmol/L范圍時(shí)，盡管CAT活性逐漸下降，但細(xì)胞活力幾乎保持不變；當(dāng)草酸濃度達(dá)到0.5mmol/L以上時(shí)，隨著草酸濃度的升高，CAT活性和細(xì)胞活力都明顯降低。

圖3草酸濃度對(duì)金鐵鎖懸浮細(xì)胞CAT活力和細(xì)胞活性的影響

Fig.3EffectsofoxalicacidconcentrationontheCATactivityandcellvitalityofP. tunicoidessuspensioncells

由圖3可知，CAT的酶活力及細(xì)胞活力與草酸濃度呈先增大后減少的關(guān)系，這是植物正常的生理反應(yīng)，即當(dāng)細(xì)胞開始受到脅迫時(shí)，細(xì)胞相關(guān)保護(hù)酶的酶活力有一定程度的增加；當(dāng)草酸濃度過高超過了植物承受的閾值時(shí)，則相應(yīng)保護(hù)酶的酶活力會(huì)逐漸降低，進(jìn)而導(dǎo)致植物細(xì)胞受到傷害或死亡，與“2.1.1”結(jié)果及李巖[13]的結(jié)論一致。

2.2.2草酸處理時(shí)間對(duì)懸浮細(xì)胞CAT活性的影響

根據(jù)“2.2.1”的結(jié)果，選擇在暗培養(yǎng)條件下用0.1 mmol/L草酸處理金鐵鎖懸浮細(xì)胞，每隔4 h測(cè)定一次細(xì)胞CAT活性和細(xì)胞活力，結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，在處理的0～12 h，CAT活性逐漸增長并在12 h達(dá)到最大值，比開始時(shí)增加113.39%，之后酶活力開始下降；而在酶活力變化過程中，細(xì)胞活力并沒有隨草酸處理時(shí)間的延長而下降，反而有上升的趨勢(shì)。

圖4草酸處理時(shí)間對(duì)金鐵鎖懸浮細(xì)胞CAT活性和細(xì)胞活力的影響

Fig.4EffectsofdifferenttreatmenttimeofoxalicacidonCATactivityandcellvitalityofP. tunicoidessuspensioncells

隨著草酸處理時(shí)間的延長，細(xì)胞CAT活力呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)；與之相反，細(xì)胞活力表現(xiàn)出輕微上升的趨勢(shì)，說明此時(shí)細(xì)胞處于正常的生長狀態(tài)。推測(cè)原因可能是CAT在開始受到草酸脅迫時(shí)，酶活力不斷增大；當(dāng)脅迫持續(xù)一段時(shí)間后，酶活力達(dá)到最大值，而細(xì)胞活力逐漸降低到靜態(tài)水平，即反應(yīng)結(jié)束。說明當(dāng)?shù)退讲菟釢舛忍幚碇参锛?xì)胞后，會(huì)刺激植物細(xì)胞的抗逆反應(yīng)，通過細(xì)胞CAT活性的變化以應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫[12]。

2.3草酸對(duì)懸浮細(xì)胞皂苷含量的影響

2.3.1草酸處理濃度對(duì)細(xì)胞皂苷積累的影響

根據(jù)“2.1”和“2.2”的結(jié)果，在培養(yǎng)條件下用不同濃度草酸處理金鐵鎖懸浮細(xì)胞，15d后測(cè)定細(xì)胞中總皂苷含量的變化，結(jié)果見表1。表1結(jié)果表明，皂苷含量并不隨著草酸處理濃度的增加而升高，0.1mmol/L草酸處理的細(xì)胞中皂苷含量最大，比對(duì)照組增加了10%；當(dāng)草酸濃度大于0.1 mmol/L時(shí)，隨著草酸濃度的增大，皂苷含量逐漸降低。這可能是由于高濃度草酸處理嚴(yán)重傷害了細(xì)胞，甚至引起細(xì)胞的程序化死亡，反而導(dǎo)致細(xì)胞合成皂苷的能力下降[13]。

表1草酸處理濃度對(duì)金鐵鎖懸浮細(xì)胞皂苷含量影響

Tab.1EffectsofoxalicacidconcentrationonthesaponincontentofP. tunicoidessuspensioncells

c/(mmol·L-1)w/%0(對(duì)照)0.352±0.00620.050.368±0.00220.10.386±0.00230.50.369±0.00441.00.357±0.00295.00.349±0.0014

2.3.2草酸處理時(shí)間對(duì)細(xì)胞皂苷含量的影響

選擇0.1 mmol/L草酸處理金鐵鎖懸浮細(xì)胞，在指定時(shí)間內(nèi)測(cè)定皂苷含量，以未經(jīng)草酸處理的樣品為對(duì)照，結(jié)果如表2所示。

表2草酸處理時(shí)間對(duì)金鐵鎖懸浮細(xì)胞皂苷含量影響

Tab.2EffectsofdifferenttimeofoxalicacidtreatmentonthesaponincontentofP. tunicoidessuspensioncells

處理時(shí)間/dw/%對(duì)照組0.1mmol/L0(對(duì)照)0.354±0.00220.355±0.003170.357±0.00280.377±0.0026140.359±0.00170.386±0.0038210.351±0.00210.386±0.0046280.357±0.00190.386±0.0025

表2表明，雖然草酸處理的細(xì)胞中皂苷含量增加較快，但當(dāng)處理時(shí)間超過14 d后，皂苷含量幾乎沒有變化，可能是由于細(xì)胞衰老、培養(yǎng)基pH下降等原因，導(dǎo)致細(xì)胞合成皂苷速度下降并停止，使細(xì)胞中皂苷含量達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡并緩慢下降。

2.4光照對(duì)草酸處理細(xì)胞的CAT酶活力的影響

選取0.1 mmol/L草酸處理懸浮細(xì)胞后，分別在光照和黑暗下培養(yǎng)，其中光照的光強(qiáng)為3 000 lx，光照時(shí)間24 h/d。CAT活性和細(xì)胞活力的變化如圖5所示。由圖5可以看出，暗培養(yǎng)與光照條件下的金鐵鎖懸浮細(xì)胞的CAT活性都是呈現(xiàn)先增加再降低的趨勢(shì)，二者的酶活力的最大值分別出現(xiàn)在16和24 h。16 h內(nèi)，暗培養(yǎng)與光培養(yǎng)下細(xì)胞的CAT吸光度每小時(shí)分別提高1.67×10-2和1.16×10-2；28～32h內(nèi)暗培養(yǎng)與光培養(yǎng)下細(xì)胞的CAT酶活力每小時(shí)分別降低0.79×10-2和0.57×10-2。結(jié)果表明，光照培養(yǎng)可以讓懸浮細(xì)胞CAT活力更長時(shí)間地維持高水平狀態(tài)，從而有利于細(xì)胞對(duì)活性氧的清除作用。

圖5光照下金鐵鎖懸浮細(xì)胞CAT活性和細(xì)胞活力與草酸處理時(shí)間的關(guān)系

Fig.5EffectofdifferenttreatmenttimeofoxalicacidonCATactivityandcellvitalityofP. tunicoidessuspensioncellsunderillumination

2.5光照對(duì)草酸刺激懸浮細(xì)胞皂苷合成的影響

在與“2.4”同樣反應(yīng)條件下，在指定時(shí)間內(nèi)測(cè)定皂苷含量變化，結(jié)果見表3。

表3光照對(duì)草酸刺激金鐵鎖懸浮細(xì)胞皂苷合成的影響

Tab.3EffectsofilluminationonthesynthesisofsaponinsofP. tunicoidessuspensioncellsinducedbyoxalicacid

處理時(shí)間/dw/%暗培養(yǎng)光培養(yǎng)0(對(duì)照)0.355±0.00310.352±0.002470.377±0.00260.355±0.0042140.386±0.00380.363±0.0025210.386±0.00460.362±0.0035280.386±0.00250.373±0.0023

表3結(jié)果表明，光照條件下，雖然細(xì)胞中皂苷含量增加緩慢，但保持持續(xù)增長；而在暗培養(yǎng)下皂苷含量幾乎不變，光照下細(xì)胞中皂苷含量依然穩(wěn)定增長。結(jié)果說明，光照有利于草酸誘導(dǎo)的金鐵鎖細(xì)胞中皂苷積累。

3討論

草酸是植物細(xì)胞產(chǎn)生的簡(jiǎn)單二元酸，也是植物細(xì)胞-微生物互作時(shí)病原菌分泌的重要致病因子[14]，有研究表明它還是一種重要的非生物激發(fā)子，可以誘導(dǎo)植物中一些與防御反應(yīng)相關(guān)酶活性的提高[15]，或能增強(qiáng)辣椒葉片的抗熱性[16]；HUDGINS等[17]對(duì)46種松科植物研究發(fā)現(xiàn)，草酸鈣在植物細(xì)胞中可以形成一種保護(hù)防御膜，能夠有效地阻擋昆蟲對(duì)植物的損害。GUO等[18]研究發(fā)現(xiàn)，草酸鹽生物合成能夠增強(qiáng)植物細(xì)胞內(nèi)的L-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯含量，有效提高植物非生物脅迫耐受。

本研究發(fā)現(xiàn)，草酸使金鐵鎖懸浮細(xì)胞的膜透性增加，這表明在植物細(xì)胞培養(yǎng)中添加草酸對(duì)細(xì)胞造成一定影響；同時(shí)，草酸處理會(huì)提高懸浮細(xì)胞的CAT酶活和細(xì)胞活力。皂苷是金鐵鎖的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是金鐵鎖的活性成分之一。一定濃度的草酸處理可以促進(jìn)金鐵鎖懸浮細(xì)胞皂苷積累，說明草酸與細(xì)胞的相互作用可以促進(jìn)細(xì)胞的次級(jí)代謝，但如果把草酸應(yīng)用于以植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級(jí)代謝物中，應(yīng)該考慮草酸濃度、時(shí)間等方面的因素，否則細(xì)胞衰老死亡的速度過快，反而會(huì)影響植物細(xì)胞培養(yǎng)成本。

金鐵鎖懸浮細(xì)胞培養(yǎng)一般在暗培養(yǎng)中進(jìn)行，但本實(shí)驗(yàn)通過光、暗培養(yǎng)比較，發(fā)現(xiàn)光照對(duì)草酸處理后的細(xì)胞CAT活性有較大影響，光培養(yǎng)下細(xì)胞經(jīng)草酸處理后其CAT活性增加速率較暗培養(yǎng)下慢，但是CAT活性能夠長時(shí)間地維持高活性，從而有利于細(xì)胞的抗逆作用；盡管光培養(yǎng)下的懸浮細(xì)胞皂苷積累稍微低于暗培養(yǎng)下的懸浮細(xì)胞，但由于光培養(yǎng)下的懸浮細(xì)胞生長時(shí)間持久，總皂苷產(chǎn)量反而增加。綜上，在使用草酸作為誘導(dǎo)子作用于金鐵鎖懸浮細(xì)胞時(shí)，可以考慮適當(dāng)提供光照，一方面保護(hù)細(xì)胞免受或減輕傷害，還可以提高植物細(xì)胞的次生代謝水平。

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Effects of oxalic acid on suspension culture cells ofPsammosilenetunicoides

PANMiaomiao,YANGYuying,ZHANGJian,JINZhaoxia,

ZHANGMengxia,ZHANGZongshen

( School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

Abstract:The effects of oxalic acid on the physiological responses of Psammosilene tunicoides suspension cells under dark and illumination were investigated. The results showed that oxalic acid could increase cell membrane permeability, which was of exogenous oxalic acid concentration-dependent. Oxalic acid could also increase the CAT activity and saponin content in cellular. The CAT activity in suspension cells could be maintained for a long time when the oxalic acid-treated suspension cells were exposed on 3 000 lx light strength. So the addition of oxalic acid could improve the accumulation of saponins in the suspension cells of P. tunicoides, and illumination could facilitate the function of oxalic acid as an elicitor in this process.

Key words:Psammosilene tunicoides; suspension cells; oxalic acid; illumination

文章編號(hào):1674-1404(2015)06-0401-03

通信作者：

作者簡(jiǎn)介:潘苗苗(1990-)，男，碩士研究生；張宗申(1968-)，男，教授.

基金項(xiàng)目:科技部中小企技術(shù)創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(12C26214104279).

收稿日期:2015-01-06.

中圖分類號(hào):Q942.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A