羅建峰　吳華杰　石曌玲

張敏龍2　金發(fā)光2

1,25-二羥維生素D3抑制RhoA/ROCK通路減輕幼鼠海水淹溺型肺損傷的實(shí)驗(yàn)研究

羅建峰1吳華杰1石曌玲1

張敏龍2金發(fā)光2

淹溺是全球第三大意外死亡原因。據(jù)報(bào)道，每年因淹溺導(dǎo)致的死亡人數(shù)接近150萬(wàn)，目前也是我國(guó)0～14歲年齡組人群第一位的死因，而海水淹溺導(dǎo)致的死亡在其中占據(jù)了一大部分[1- 2]。呼吸心搏驟停是淹溺兒童致死最常見(jiàn)原因，而存活下來(lái)的患兒往往合并急性肺損傷(acute lung injury, ALI)和急性呼吸窘迫綜合癥(acute respiratory distress syndrome, ARDS)。前期大量研究表明，海水吸入導(dǎo)致了肺組織屏障通透性的增加，從而引起了肺泡腔和肺間質(zhì)嚴(yán)重的水腫。

RhoA/ROCK (Rho-associated coil forming protein kinase) 通路是鈣敏感的信號(hào)通路，該通路通過(guò)影響肌球蛋白ATP酶的活性對(duì)細(xì)胞骨架收縮反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控[3]。在細(xì)胞骨架收縮反應(yīng)中，ROCK引起肌球蛋白輕鏈(light-chain of myosin, MLC)的磷酸化，而磷酸化的MLC最終促進(jìn)了肌球蛋白ATP酶的激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞骨架蛋白的重組、張力纖維成型以及細(xì)胞的收縮[4]。因此，RhoA/ROCK信號(hào)通路在細(xì)胞屏障通透性的增加中起到了重要作用。另外，研究證實(shí)RhoA/ROCK信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)方面也有明顯的效果。

1,25-二羥維生素D3[1,25-(OH)2VitD3]除了已知的調(diào)節(jié)鈣和磷的代謝外，還具有免疫調(diào)節(jié)的功能。已有研究表明，1,25-二羥維生素D3在抑制中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)和炎癥因子的產(chǎn)生方面有著顯著作用[5-6]。本實(shí)驗(yàn)觀察了1,25-二羥維生素D3對(duì)于肺組織水腫和通透性的影響，并且進(jìn)一步探討了RhoA/ROCK信號(hào)通路在海水吸入型肺損傷中的相關(guān)作用機(jī)制。在我們之前的研究中，地塞米松已經(jīng)被證實(shí)對(duì)于海水吸入型肺損傷具有良好的干預(yù)效果[7-8]。因此，本課題組選擇了該藥物作為陽(yáng)性治療對(duì)照。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

選擇健康雄性21日齡SD(Sprague-Dawley)幼鼠32只，清潔級(jí)，體質(zhì)量44～61 g，第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1,25-二羥維生素D3(HPLC≥99%)和地塞米松(HPLC≥98%)均購(gòu)自Sigma公司，1,25-二羥維生素D3灌注液用10%甲醇-1‰Triton X-100溶液制成，地塞米松灌注液用5‰羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethylcellulose)溶液制成。配方海水根據(jù)中國(guó)國(guó)家海洋局第三海洋研究所海洋生化研究室提供的我國(guó)東南沿海海水的主要成分配制：NaCl 26.518 g/L，MgSO43.305 g/L，MgCl22.447 g/L，CaCl21.141 g/L，NaHCO30.202 g/L，KCl 0.725 g/L，NaBr 0.083 g/L；pH 8.2，相對(duì)密度1.05，滲透壓1 300 mmol/L。炎癥因子 ELISA試劑盒購(gòu)于R&D公司。β-actin、RhoA、MYPT-1和磷酸化MYPT-1(p-MYPT1)抗體均購(gòu)于Santa Cruz公司。

二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

用完全隨機(jī)方法將實(shí)驗(yàn)幼鼠共32只分為四組，每組8只：A：空白對(duì)照組，B：海水處理組，C：VitD3處理組，D：地塞米松處理組。各組幼鼠分別在海水滴入前1h灌胃處理：A和B組：生理鹽水；C組：25 μg/kgVitD3；D組：10 mg/kg地塞米松。幼鼠海水肺損傷模型的制備：幼鼠通過(guò)腹腔注射3%戊巴比妥鈉(1.5 ml/kg)進(jìn)行麻醉，仰臥固定，氣管切開(kāi)插入氣管導(dǎo)管后維持自主呼吸，后取1 ml的注射器插入氣管，在4 min之內(nèi)緩慢注入3 ml/kg海水。模型制備完成后，放血處死并切取肺組織。

三、檢測(cè)指標(biāo)及方法

1. 肺組織濕干重比值(W/D ratio)測(cè)定：取每只幼鼠右肺上葉，濾紙吸去表面水分和血跡，電子天平稱濕重，后置于55 ℃烘干箱中72 h至恒重，稱量干重，分別以濕重除以干重即為濕干比。

2. 伊文思藍(lán)法檢測(cè)肺組織通透性：在各組幼鼠處死前，將伊文思藍(lán)(20 mg/kg體重)靜脈注射到幼鼠體內(nèi)，迅速取出幼鼠肺組織并用生理鹽水注射入右心室，沖洗肺組織，直到左心房流出液為無(wú)色透明為止。之后，將肺組織在60 ℃下干燥72 h，干肺稱重后被放入60 ℃甲酰胺中(3 ml/100 mg)，上清液以離心半徑8 cm，1 200 r/min離心30 min，在620 nm檢測(cè)光密度值，通過(guò)比對(duì)伊文思藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出各樣本中伊文思藍(lán)濃度(μg/g組織)。

3. TNF-α和IL-1β檢測(cè)：用ELISA試劑盒檢測(cè)肺組織TNF-α和IL-1β的含量，上述測(cè)量過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒相關(guān)說(shuō)明要求操作。

4. Western-blot檢測(cè)RhoA、GTP-RhoA、MYPT-1和p-MYPT1蛋白表達(dá)：幼鼠肺組織用裂解液處理，裂解產(chǎn)物離心(以離心半徑8 cm，1 200 r/min離心30 min，4 ℃)，收集上清。將等量的不同蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，之后在100 V電壓低溫下轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜上，用5%的脫脂牛奶封閉2 h。加入1︰1 000稀釋的一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，反復(fù)洗脫后，加入1︰5 000稀釋的羊抗兔二抗，37 ℃溫育1 h，用ECL系統(tǒng)顯色，避光保存并照相，做灰度掃描處理，結(jié)果用目的蛋白與β-actin的相對(duì)比值表示。RhoA活性檢測(cè)采用Rho pull-down (Upstate Biotechnology公司)分析法檢測(cè)，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果

一、肺組織濕干比值(W/D ratio)和肺組織通透性結(jié)果

各組幼鼠氣管內(nèi)滴入海水4 h后，肺組織濕干比和伊文思藍(lán)通透性明顯增加(P<0.001)，VitD3和地塞米松能夠明顯降低肺組織濕干比和通透性，但VitD3與地塞米松治療效果無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖1。

圖1各組幼鼠肺組織濕干比值(W/D)和肺組織通透性結(jié)果，A：空白對(duì)照組，B：海水4 h組，C：VitD3處理組，D：地塞米松處理組n=8；***P<0.001vs. 空白對(duì)照組；###P<0.001，##P<0.01vs. 海水4 h組

二、炎癥因子檢測(cè)結(jié)果

海水處理4 h后幼鼠肺組織勻漿中TNF-α和IL-1β的含量顯著增加(P<0.001)，VitD3和地塞米松明顯抑制了炎癥因子的表達(dá)(P<0.05)，VitD3與地塞米松治療效果無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖2。

圖2各組幼鼠肺組織炎癥因子檢測(cè)結(jié)果，A：空白對(duì)照組，B：海水4 h組，C：VitD3處理組，D：地塞米松處理組n=8；***P<0.001vs. 空白對(duì)照組；##P<0.01，#P<0.05vs. 海水4 h組

三、RhoA活性檢測(cè)結(jié)果

海水處理4 h后幼鼠肺組織中GTP-RhoA表達(dá)顯著增加(P<0.001)，VitD3和地塞米松能夠明顯抑制RhoA的激活(P<0.05)，但VitD3效果好于地塞米松(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3各組幼鼠肺組織活性RhoA檢測(cè)結(jié)果，A：空白對(duì)照組，B：海水4 h組，C：VitD3處理組，D：地塞米松處理組n=8；***P<0.001vs. 空白對(duì)照組；###P<0.001，#P<0.05vs. 海水4 h組；○P<0.05vs. 地塞米松處理

四、MYPT-1磷酸化檢測(cè)結(jié)果

MYPT-1(myosin phosphatase target subunit 1)作為肌球蛋白輕鏈磷酸酶調(diào)節(jié)亞單位，是RhoA信號(hào)通路的下游效應(yīng)分子。海水處理4 h后幼鼠肺組織中p-MYPT1表達(dá)明顯增加(P<0.001)，VitD3和地塞米松能夠顯著抑制MYPT-1的激活(P<0.05)，但VitD3效果好于地塞米松(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4各組幼鼠肺組織磷酸化MYPT-1檢測(cè)結(jié)果，A：空白對(duì)照組，B：海水4 h組，C：VitD3處理組，D：地塞米松處理組n=8；***P<0.001vs. 空白對(duì)照組；###P<0.001vs. 海水4 h組；○P<0.05vs. 地塞米松處理組

討論

小兒海水淹溺后會(huì)發(fā)生一系列的病理變化，其中最主要的是炎癥反應(yīng)和肺組織屏障通透性增加引起的肺組織水腫。高滲的海水吸入肺泡時(shí)，通過(guò)高滲效應(yīng)和肺屏障通透性的破壞，會(huì)使大量液體和炎癥細(xì)胞滲出，并在肺泡腔和肺間質(zhì)集聚，同時(shí)這些炎癥細(xì)胞分泌大量的炎癥因子和活性氧基團(tuán)，進(jìn)一步加重了肺損傷。這表明了肺組織屏障的破壞是海水吸入肺損傷的關(guān)鍵發(fā)病環(huán)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)海水吸入后，幼鼠肺組織濕干比顯著增加，肺組織屏障通透性也明顯增加，同時(shí)炎癥因子的表達(dá)也增高。而1,25-二羥維生素D3則減輕了肺組織的炎癥和水腫反應(yīng)。

目前治療上除機(jī)械通氣外，規(guī)范的藥物治療仍在進(jìn)一步研究中[9]。1,25-二羥維生素發(fā)揮免疫調(diào)控的作用是通過(guò)與細(xì)胞核內(nèi)維生素D受體相結(jié)合，從而進(jìn)一步調(diào)控其下游基因發(fā)揮效應(yīng)[10]。近期諸多研究表明，在人類(lèi)白細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、以及成纖維細(xì)胞中，1,25-二羥維生素D3主要起抑制炎癥反應(yīng)以及調(diào)節(jié)免疫的作用[11-14]。此外，1,25-二羥維生素D3在前列腺細(xì)胞增生過(guò)程中可抑制細(xì)胞骨架的重構(gòu)[15]。

RhoA分子屬于小分子G蛋白家族，主要通過(guò)其下游效應(yīng)分子Rho激酶ROCK發(fā)揮作用。ROCK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。激活狀態(tài)的RhoA即GTP-RhoA與ROCK結(jié)合，進(jìn)一步磷酸化其下游底物MYPT-1，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種行為，包括細(xì)胞形狀改變、遷移等[3]。近年來(lái)多個(gè)研究表明，RhoA/ROCK信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)以及細(xì)胞骨架重構(gòu)方面也有著重要作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)海水刺激可導(dǎo)致幼鼠肺組織中RhoA分子的激活，同時(shí)引起其下游MYPT-1分子的磷酸化。而1,25-二羥維生素D3可顯著的抑制了肺組織中RhoA分子的激活，同時(shí)也抑制MYPT-1分子的磷酸化。綜上，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明RhoA/ROCK信號(hào)通路在幼鼠海水淹溺型肺損傷的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用。同時(shí)也部分解釋了1,25-二羥維生素D3在幼鼠海水淹溺型肺損傷中的作用機(jī)制，并且為1,25-二羥維生素D3在小兒海水淹溺型肺損傷的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(本文編輯：張大春)

羅建峰，吳華杰，石曌玲，等. 1,25-二羥維生素D3通過(guò)抑制RhoA/ROCK通路減輕幼鼠海水淹溺型肺損傷[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2015， 8(5)： 565-568.

·論著·

【摘要】目的探討1,25-二羥維生素D3對(duì)幼鼠海水吸入型肺損傷的干預(yù)作用及其機(jī)制。方法32只SD幼鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、海水處理組、活性VitD3處理組和地塞米松處理組，每組8只。海水處理組幼鼠給予氣管內(nèi)灌注3 ml/kg海水，VitD3處理組和地塞米松處理組在海水處理組的基礎(chǔ)上分別給予25 μg/kg VitD3和10 mg/kg地塞米松灌胃處理。分別檢測(cè)各組肺組織濕干比和通透性變化，ELISA法檢測(cè)肺組織中炎癥因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞-1β(IL-1β)的表達(dá)，Western blot檢測(cè)GTP-RhoA和磷酸化MYPT-1的表達(dá)變化。結(jié)果與正常對(duì)照組比較，海水氣管內(nèi)滴入4 h后幼鼠肺部組織出現(xiàn)明顯炎癥和水腫，炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)顯著增高，RhoA的活化和MYPT-1磷酸化增加；1,25-二羥維生素D3和地塞米松干預(yù)可顯著減輕海水導(dǎo)致的肺組織損傷，減少了TNF-α和IL-1β的釋放，并且抑制了RhoA的活化和MYPT-1的磷酸化。結(jié)論RhoA/ROCK通路參與幼鼠海水吸入型肺損傷的發(fā)展，1,25-二羥維生素D3能夠通過(guò)調(diào)節(jié)該信號(hào)通路減輕肺損傷。

【關(guān)鍵詞】急性肺損傷；海水；1,25-二羥維生素D3；RhoA/ROCK；幼鼠

1,25-(OH)2VitD3alleviates seawater drowning-induced acute lung injury in young rats by inhibiting RhoA/ROCK pathwayLuoJianfeng1,WuHuajie1,ShiZhaoling1,ZhangMinlong2,JinFaguang2.1DepartmentofPaediatrics,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China;2DepartmentofRespiratoryDisease,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710038,China

Correspondingauthor：JinFaguang,Email:jinfag@fmmu.edu.cn

【Abstract】ObjectiveTo observe the therapeutic effect of 1,25-(OH)2VitD3in seawater aspiration-induced acute lung injury of young rats and explore the possible mechanisms. MethodsYoung SD rats were randomly divided into 4 groups, 8 in each group: control group, seawater group, VitD3pre-treated group and dexamethasone pre-treated group. Seawater (3 ml/kg) was instilled into the airway of young rats in seawater group. Rats in VitD3group and dexamethasone group were injected with 25 μg/kg VitD3or 10 mg/kg dexamethasone followed by seawater. W/D ratio and lung tissue permeability detection was carried out after modeling. The expression of TNF-α and IL-1β were measured by ELISA and the expression of GTP-RhoA and phospho-MYPT1 were measured by Western blot. ResultsCompared with control group, lung tissue inflammation and edema were obvious and the expression of TNF-α and IL-1β were increased after 4 h seawater stimulation. The expression of GTP-RhoA and phospho-MYPT1 were up-regulated. However, administration of 1,25-(OH)2VitD3attenuated lung inflammation and edema, suppressed the release of TNF-α and IL-1β, and inhibited the expression of GTP-RhoA and phospho-MYPT1. ConclusionRhoA/ROCK pathway plays important role in the seawater aspiration-induced acute lung injury of young rats and 1,25-(OH)2VitD3attenuated lung injury by inhibiting RhoA/ROCK pathway.

【Key words】Acute lung injury;Seawater;1,25-(OH)2VitD3;RhoA/ROCK;Young rats

收稿日期：(2015-04-10)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：中圖法分類(lèi)號(hào)： R563 A

通訊作者：金發(fā)光，Email: jinfag@fmmu.edu.cn

基金項(xiàng)目：作者單位： 710032 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院兒科1;710038 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科2

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.05.007