高延才，杜愛玲，張林朋，張合鵬，曹少鵬，王振剛，季泰令(濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊6053;濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

AG490對(duì)大鼠腦缺血損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

高延才1，杜愛玲2，張林朋1，張合鵬1，曹少鵬1，王振剛2，季泰令2(1濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261053;2濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

摘要:目的研究JAK激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK/STAT)信號(hào)通路的阻斷劑AG490對(duì)大鼠腦缺血損傷的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。方法用健康SD大鼠制作大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型，隨機(jī)分為四組:mCAO組、假手術(shù)組、高劑量AG490干預(yù)組和低劑量AG490干預(yù)組。MCAO組采用左側(cè)頸外動(dòng)脈插栓法造模;假手術(shù)組不插栓，結(jié)扎并剪斷左側(cè)頸外動(dòng)脈，夾閉左側(cè)頸總動(dòng)脈1 h后撤動(dòng)脈夾，縫皮;高劑量AG490干預(yù)組和低劑量AG490干預(yù)組在造模成功后1 h分別給予腹腔注射6、3mg/kg AG490，MCAO組和假手術(shù)組給予等量生理鹽水。動(dòng)物麻醉清醒后6、12、24 h，應(yīng)用神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分評(píng)價(jià)腦缺血損傷程度;動(dòng)物麻醉清醒后24 h用2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色技術(shù)檢測(cè)腦組織梗死范圍，ELISA法檢測(cè)腦組織內(nèi)腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素1β(IL-1β)水平。結(jié)果大鼠麻醉清醒后24 h，與假手術(shù)組比較，MCAO組、高劑量AG490干預(yù)組和低劑量AG490干預(yù)組神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分、TNF-α和IL-1β水平高，腦組織梗死范圍大(P＜0.05或＜0.01);與MGAO組比較，高劑量AG490干預(yù)組、低劑量AG490干預(yù)組神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分低，TNF-α、IL-1β水平低，腦組織梗死范圍小(P均＜0.01)。結(jié)論AG490對(duì)大鼠腦缺血損傷具有保護(hù)作用，其作用是通過(guò)抑制JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)通路、減輕炎癥反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞:腦缺血; AG490; JAK激酶;信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子;大鼠

腦血管病在人類各種疾病死因中一直位于前3位，成為人類死亡的主要原因。其中缺血性腦血管病(ICVD)臨床較多見，約占全部腦血管病患者的85%，最為常見的是大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)引起的。由于大鼠的腦血管分布與人腦部血管類似，而且愈合能力強(qiáng)、易于飼養(yǎng)、便于操作，因此本實(shí)驗(yàn)采用了目前常見的大鼠MCAO模型。AG490是一種人工合成的苯亞甲基丙二腈的脂類衍生物，是JAK激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK/STAT)信號(hào)通路的阻斷劑［1］。目前研究表明，JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多個(gè)生物學(xué)分化過(guò)程，與腦外傷、腦腫瘤、免疫反應(yīng)機(jī)制等相關(guān)［2］。2014年10月～2015年6月，我們就AG490對(duì)腦缺血損傷的作用及其作用機(jī)制進(jìn)行了相關(guān)探討?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1材料雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～280 g(北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司)，潔凈動(dòng)物房飼喂，大鼠自由飲水進(jìn)食，飼喂3d，適應(yīng)環(huán)境后進(jìn)行試驗(yàn); AG490(美國(guó)BioLegend公司); 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(北京化學(xué)試劑公司); TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒(北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)。

1.2動(dòng)物分組與MCAO模型建立依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將大鼠分為4組:假手術(shù)組、MCAO組、低劑量AG490(3mg/kg)干預(yù)組和高劑量AG490(6mg/kg)干預(yù)組。大鼠均采用腹腔注射麻醉(10%水合氯醛0.3mL/100 g)，MCAO組采用頸外動(dòng)脈插栓法，做頸正中切口，暴露頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)及頸內(nèi)動(dòng)脈，將0.26mm單絲尼龍魚線頭端0.5 cm用石蠟包被，并于20mm處標(biāo)記，大鼠均通過(guò)左側(cè)ECA切口處插入，栓線長(zhǎng)度自CCA分叉處18～20mm，根據(jù)動(dòng)物體質(zhì)量而定，栓塞左側(cè)大腦中動(dòng)脈，然后縫合皮膚，栓線尾端部分固定于皮膚上。缺血達(dá)到2 h后小心抽出栓線，即形成再灌注。假手術(shù)組只是不插入尼龍魚線，其余步驟同MCAO組。低劑量AG490干預(yù)組和高劑量AG490干預(yù)組分別于術(shù)前24 h給予3mg/kg和6mg/kg的AG490腹腔注射，其余步驟同MCAO組。在缺血期間及再灌注后2 h保持體溫在(37±0.5)℃。以大鼠手術(shù)麻醉清醒后出現(xiàn)右側(cè)肢體癱瘓，站立不穩(wěn)，提尾時(shí)向一側(cè)轉(zhuǎn)圈為模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3腦缺血損傷程度的評(píng)價(jià)采用神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。參考Ergul等［3］的5分制法，在動(dòng)物麻醉清醒后6、12、24 h進(jìn)行評(píng)分。0分:無(wú)神經(jīng)損傷癥狀; 1 分:不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪; 2分:向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈; 3分:向?qū)?cè)傾倒; 4分:不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。分值越高，說(shuō)明動(dòng)物行為障礙越嚴(yán)重。

1.4腦組織梗死范圍的檢測(cè)采用TTC染色法。動(dòng)物麻醉清醒后24 h將大鼠斷頭，取出完整的腦組織，迅速置于－20℃的冰箱中，凍存20min。切成5～6片，每隔2mm切一片。第一刀在腦前極與視交叉連線中點(diǎn)處;第二刀在視交叉部位;第三刀在漏斗柄部位;第四刀在漏斗柄與后葉尾極之間［4］。切片應(yīng)均勻。將切片置于TTC中，常規(guī)濃度為2%，用錫箔紙蓋住后，放入37℃恒溫箱15～30min，不時(shí)翻動(dòng)腦片，保證均勻接觸到染色液。最后，數(shù)碼相機(jī)拍照，計(jì)算機(jī)計(jì)算梗死區(qū)域體積所占大腦半球總體積的百分比。

1.5腦組織TNF-α和IL-1β測(cè)定動(dòng)物麻醉清醒后24 h，選取栓塞缺血同側(cè)的大鼠腦組織，勻漿處理腦組織，然后離心，取上清液。采用ELISA法，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作測(cè)定腦組織TNF-α 和IL-1β水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較采用秩和檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組不同時(shí)間神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較見表1。

表1　各組不同時(shí)間神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較(分，)

表1　各組不同時(shí)間神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較(分，)

注:與MCAO組同期比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別　n 24 h神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分動(dòng)物麻醉清醒后6 h動(dòng)物麻醉清醒后12 h動(dòng)物麻醉清醒后假手術(shù)組　10　0＊＊　0＊＊　0＊＊MCAO組　15 1.82±0.58 2.10±0.47 2.68±0.49低劑量AG490干預(yù)組　15 1.67±0.73 2.05±0.80 1.82±0.85*高劑量AG490干預(yù)組　15 1.65±0.96 1.98±1.02 1.73±0.62*

2.2各組腦組織梗死范圍比較假手術(shù)組無(wú)腦組織梗死發(fā)生，MCAO組腦組織梗死范圍為(16.84± 4.60)%，低劑量AG490干預(yù)組為(10.37± 2.60)%，高劑量AG490干預(yù)組為(8.26±3.07)%。MCAO組、高劑量AG490干預(yù)組和低劑量AG490干預(yù)組腦組織梗死范圍均高于假手術(shù)組(P均＜0.01);高劑量AG490干預(yù)組、低劑量AG490干預(yù)組和MCAO組腦組織梗死范圍依次增高(P均＜0.01)。

2.3各組腦組織TNF-α和IL-1β水平比較見表2。

表2　各組腦組織TNF-α和IL-1β水平比較(mg/g，)

表2　各組腦組織TNF-α和IL-1β水平比較(mg/g，)

注:與MCAO組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別　n　TNF-α　IL-1β假手術(shù)組　10　0.354±0.070＊＊1.647±0.377＊＊MCAO組　10　1.301±0.348　2.703±0.467低劑量AG490干預(yù)組　10　0.625±0.220*1.632±0.340＊＊

3　討論

目前，面對(duì)日益加重的老齡化問題，心腦血管疾病已經(jīng)成為危害人們身體健康的主要疾病，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增高的趨勢(shì)。腦缺血損傷后的區(qū)域主要表現(xiàn)為炎癥反應(yīng)，包括氧自由基產(chǎn)生、水解酶生成、溶酶體破壞、白細(xì)胞聚集以及炎癥介質(zhì)形成等方面。腦缺血損傷后的一系列炎癥反應(yīng)，最終會(huì)導(dǎo)致血腦屏障受損，內(nèi)皮細(xì)胞的參與會(huì)加重腦損害，引起腦水腫。以上的病理生理過(guò)程中會(huì)有各種各樣的炎性因子參與其中，包括TNF-α和IL-1β。

IL-1β是IL-1在腦組織中主要的活性形式，可由內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等多種活性細(xì)胞合成和分泌。其不僅能協(xié)同其他細(xì)胞因子促進(jìn)T、B細(xì)胞活化，還能誘導(dǎo)其他炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞的黏附，調(diào)節(jié)TNF-α和IL-6的產(chǎn)生［5，6］。目前認(rèn)為，IL-1β是一種重要的炎性因子，其失控性表達(dá)是炎癥反應(yīng)失控性發(fā)生、發(fā)展的重要因素，是反映腦缺血急性期損傷程度的標(biāo)志物［7］。它誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與JAK/STAT信號(hào)通路密切相關(guān)［8］。TNF-α具有觸發(fā)和級(jí)聯(lián)放大炎癥反應(yīng)的作用，是誘導(dǎo)過(guò)度炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵性促炎因子，在缺血性腦血管病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，是腦缺血形成后腦組織梗死的主要原因［9，10］。其可誘導(dǎo)細(xì)胞黏附因子表達(dá)，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)釋放和聚集，在腦缺血損傷后期的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和組織損傷中發(fā)揮很大作用，因此降低TNF-α的表達(dá)是對(duì)腦缺血損傷后神經(jīng)功能障礙的一種保護(hù)性措施。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，MCAO組、高劑量AG490干預(yù)組和低劑量AG490干預(yù)組神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分、TNF-α和IL-1β水平高，腦組織梗死范圍大;與MCAO組比較，高劑量AG490干預(yù)組、低劑量AG490干預(yù)組神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分低，TNF-α、IL-1β水平低，腦組織梗死范圍小。提示AG490可通過(guò)降低TNF-α和IL-1β水平，抑制炎癥反應(yīng)從而起到腦組織保護(hù)作用。

研究表明，眾多細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)需要借助JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其在缺血性腦血管病中的作用越來(lái)越受到關(guān)注［11］。本實(shí)驗(yàn)采用的干預(yù)藥物AG490是一種選擇性拮抗JAK2酪氨酸磷酸化的抑制劑，能有效地阻斷下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子STAT的活化，特異性地抑制JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而有效地阻斷其信號(hào)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。結(jié)果顯示采用AG490阻斷JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后，大鼠腦缺血損傷后的神經(jīng)功能損傷程度減輕、腦組織梗死范圍縮小和炎癥反應(yīng)減輕，因此推斷AG490通過(guò)抑制JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路保護(hù)腦缺血損傷。

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·臨床研究·

收稿日期:( 2015-07-06)

文章編號(hào):1002-266X(2015)37-0031-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R651.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.37.010