李修陽，張寧，任健，徐琬梨，李毓秋，劉家義(山東中醫(yī)藥大學，濟南250355)

多囊卵巢綜合征痰濕證患者血清代謝組學分析及其生物標志物篩選

李修陽，張寧，任健，徐琬梨，李毓秋，劉家義(山東中醫(yī)藥大學，濟南250355)

摘要:目的應(yīng)用基于核磁共振的代謝組學方法研究多囊卵巢綜合征(PCOS)痰濕證患者和健康人的血清代謝物的差異，探討與PCOS痰濕證相關(guān)的生物標志物及其發(fā)病機制。方法對收集到的PCOS痰濕證患者、健康人臨床血清樣本進行核磁共振氫譜預(yù)處理，隨后使用SIMCA-P +軟件進行模式識別多變量分析。經(jīng)主成分分析法、偏最小二乘法-判別分析方法分析數(shù)據(jù)后，再經(jīng)正交偏最小二乘法-判別分析進行修正，通過分析組間的差異代謝成分，最終篩選鑒定出PCOS痰濕證的生物標志物。結(jié)果PCOS痰濕證患者和健康人之間的血清代謝成分存在差異。PCOS痰濕證患者較健康人血清中降低的代謝物有1-甲基組氨酸、檸檬酸、乙醇、甘油磷酸膽堿、低密度脂蛋白L1、脂質(zhì)L6(P＜0.05)，增加的有乙酰乙酸、極低密度脂蛋白L5、脂質(zhì)L7、乳酸、賴氨酸、N-乙酰糖蛋白、蘇氨酸(P＜0.05)。結(jié)論上述13種代謝物可能是PCOS痰濕證潛在的生物標志物。PCOS痰濕證患者血清代謝組分的變化機制和三羧酸循環(huán)、糖代謝、脂代謝和氨基酸代謝密切相關(guān)，主要表現(xiàn)為三羧酸循環(huán)障礙、糖代謝緩慢、脂肪動員加強。

關(guān)鍵詞:多囊卵巢綜合征;代謝組學;痰濕證;生物標志物

Metabonomic analysis and biomarker screening of serum for polycystic ovary syndrome patients with phlegm-dampness syndrome

LI Xiu-yang，ZHANG Ning，REN Jian，XU Wan-li，LI Yu-qiu，LIU Jia-yi
(Shandong University of Traditional Chinesemedicine，Jinan 250355，China)

Abstract:ObjectiveTo study thedifferences in the serummetabolites for polycystic ovary syndrome(PCOS)between patients with phlegm-dampness syndrome and healthy people with the application ofmetabonomics based on nuclearmagnetic resonance(NMR)，and to investigate the biomarkers associated with phlegm-dampness syndrome of PCOS as well as themechanism.Methods After the preparation of clinical serum samples collected from PCOS patients with phlegmdampness syndrome(phlegm-dampness syndrome group，n =20)and the healthy people(control group，n =20)，we preprocessed the hydrogen spectrum for nuclearmagnetic resonance，then using SIMCA-P + software for pattern recognition ofmultivariate analysis.After thedata were analyzed by the principal component analysis(PCA)and partial least squaresdiscriminant analysis(PLS-DA)，then they were amended by the orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis(OPLS-DA).According to the analysis ofdifferentmetabolic components，the biomarkers of phlegm-dampness syndrome of PCOS were finally screened and identified.Results There were significantdifferences in the serummetabolites between the phlegm-dampness syndrome group and the control group.The levels of 1-methyl histidine，citrate，ethanol，glycerol phosphate choline，lowdensity lipoprotein L1 and lipid L6 were lower in the phlegm-dampness syndrome group as compared with those of the control group，and statistically significantdifference was found(all P＜0.05).And the levels of acetoacetate，very lowdensity lipoprotein L5，lipid L7，lactate，lysine，n-acetyl glycoprotein and threonine were higher in the phlegm-dampness syndrome group as compared with those of the control group，and statistically significantdifference was found between the two groups(all P＜0.05).Conclusions These 13metabolites could be the potential biomarkers for PCOS patients with phlegm-dampness syndrome.The changemechanism of serummetabolites in PCOS patients was closely

related with the tricarboxylic acid cycle，glucosemetabolism，lipidmetabolism and proteinmetabolism，whichmainlymanifested thedisorders of tricarboxylic acid cycle，slowed glucosemetabolism and increased lipid and proteinmetabolism.

Key words:polycystic ovary syndrome;metabonomics; phlegm-dampness syndrome; biomarker

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期婦女常見的一種復(fù)雜的內(nèi)分泌及代謝紊亂疾病，具有高度異質(zhì)性，主要臨床表現(xiàn)為月經(jīng)失調(diào)、不孕、多毛和痤瘡，并伴有排卵功能紊亂和高雄激素血癥，發(fā)病率高達12%，是引起不排卵性不孕的主要原因。目前其發(fā)病機制尚不明確。作為系統(tǒng)生物學研究的關(guān)鍵技術(shù)和方法，代謝組學是繼基因組學和蛋白質(zhì)組學之后新近發(fā)展起來的一門學科，它通過系統(tǒng)研究代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，越過體內(nèi)復(fù)雜的調(diào)控過程來揭示生命活動的代謝本質(zhì)。代謝組學技術(shù)主要用于臨床診斷疾病和藥物的藥理毒理研究，其中在臨床疾病診斷方面，通過檢測分析代謝產(chǎn)物中與疾病相關(guān)的“生物標志物”進而建立疾病的代謝診斷模型。目前其已廣泛運用到很多疾病的診斷中，如冠心病、糖尿病、腫瘤等［1，2］。筆者所在課題組在2013 年3～11月探討了其在篩選PCOS痰濕證患者血清相關(guān)生物標志物中的應(yīng)用。

1　資料與方法

1.1臨床資料所選患者均來自于山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合生殖與遺傳中心，正常對照組來源于因男方因素就診的健康家屬。PCOS痰濕證患者20例(PCOS痰濕證組)，年齡(31.25±1.78)歲;正常對照組20例，年齡(29.88±2.96)歲，兩組年齡差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。PCOS診斷標準:根據(jù)歐洲人類生殖協(xié)會和美國生殖醫(yī)學協(xié)會于2003年在鹿特丹聯(lián)合(發(fā)起)制定的標準［3］:①稀發(fā)排卵和(或)無排卵;②臨床和(或)生化指標提示存在雄激素增多癥，并排除先天性腎上腺增生、分泌雄激素腫瘤和庫欣綜合征等可能致病的因素。雄激素增多癥的臨床表現(xiàn)包括痤瘡、多毛、禿頂;③卵巢多囊性改變:包括一側(cè)或雙側(cè)卵巢有≥12個直徑在2～9mm的小卵泡，和(或)卵巢體積增大＞10 cm3。以上三項具備任意兩項及以上者即可診斷為PCOS。痰濕證診斷標準:根據(jù)新世紀全國高等中醫(yī)院校教材第七版《中醫(yī)婦科學》［4］及《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》中醫(yī)證候的臨床研究指導(dǎo)原則擬定。主癥:①月經(jīng)周期延后，經(jīng)量少，經(jīng)色淡紅，質(zhì)黏膩如痰;②逐漸閉經(jīng);③婚久不孕。兼癥:①胸腹痞滿;②易惡心嘔吐;③形體肥胖;④舌淡胖或有齒印，苔膩;⑤脈滑或弦滑。具備主癥中的1項及兼癥中的3項，即可診斷。

1.2樣本采集入選病例嚴格按診斷標準執(zhí)行，囑所有受試者實驗前停服影響生殖內(nèi)分泌及代謝的藥物3個月以上，于早卵泡期(月經(jīng)3～4d)或閉經(jīng)期(B超下無優(yōu)勢卵泡)禁食8～12 h后，由專業(yè)護士抽取空腹靜脈血，離心后分離血清，置－80℃冰箱保存。所有受試者采集完后的血清標本按組編號，且與調(diào)查表的編號完全統(tǒng)一。

1.3血清樣本處理在進行核磁共振測試前，將保存于低溫冰箱的血清樣本取出并于室溫下解凍，取400 μL樣品于1.5mL離心管中，先后加入30 μL緩沖液(600mmol/L PB溶液、pH =7.4、總體積20mL，K2HPO4和NaH2PO4摩爾比為4∶1，取2.213 0 g K2HPO4·3H2O 和0.378 2 g NaH2PO4·2H2O，用重水定容至20mL)和170 μL重水(D2O)，渦旋混勻1min，然后以4℃、12 000 r/min離心10min，取上清500 μL置于直徑5mm的核磁共振管中，用于檢測。

1.4血清樣本中生物代謝產(chǎn)物的檢測實驗所用儀器是Varian 600譜儀，將裝有樣品的核磁共振管放入核磁共振波譜儀，然后進行勻場鎖場。在參數(shù)設(shè)置上，選擇在Varian 600型核磁共振波譜儀上用ID探頭采用CPMG脈沖序列進行測試，1H共振頻率599.91mHz，采樣延遲2.1 s，采集時間0.998 4 s，譜寬8 012.8 Hz，測試溫度為25℃，總回波時間100ms，累加次數(shù)128次。收集的所有樣本的血清測試，都在統(tǒng)一的參數(shù)設(shè)置、逐一參數(shù)調(diào)整后進行。1.5生物代謝產(chǎn)物的主成分分析(PCA)使用SIMCA-P +軟件(V11.0，Umetrics AB，Umea，Sweden)對歸一化后的數(shù)據(jù)進行模式識別多變量分析，PCA使用中心化換算的數(shù)據(jù)標度換算方式。

1.6生物代謝產(chǎn)物的偏最小二乘法—判別分析(PLS-DA)及模型的驗證使用SIMCA-P +軟件(V11.0，Umetrics AB，Umea，Sweden)對歸一化后的數(shù)據(jù)進行PLS，發(fā)現(xiàn)NMR數(shù)據(jù)(X變量)和其他變量(Y變量，分組信息)之間的相關(guān)關(guān)系。PLS-DA使用自適換算的數(shù)據(jù)標度換算方式。PLS-DA對模型的質(zhì)量用10折血清交叉驗證法進行檢驗，并用交叉驗證后得到的R2X和Q2(分別代表模型可解釋的變量和模型的可預(yù)測度)對模型有效性進行評判。在此之后，通過排列實驗隨機多次(n =200)改變分類變量y的排列順序得到相應(yīng)不同的隨機Q2值對模型有效性做進一步的檢驗。

1.7生物代謝產(chǎn)物的正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)使用SIMCA-P +軟件(V11.0，Umetrics AB，Umea，Sweden)進行OPLS-DA，最大化地凸

顯模型內(nèi)部兩組間的差異。OPLS-DA使用自適換算的數(shù)據(jù)標度換算方式。

2　結(jié)果

2.1生物代謝產(chǎn)物的PCA分析結(jié)果見圖1。

圖1　兩組血清圖1H-NMR譜(CPMG脈沖序列)的PCA得分圖

2.2生物代謝產(chǎn)物的PLS-DA及對模型的驗證結(jié)果見圖2。

圖2　兩組血清樣本間PLS-DA排列檢驗圖

2.3生物代謝產(chǎn)物的OPLS-DA結(jié)果見圖3。

2.4兩組生物代謝產(chǎn)物的差異通過對OPLS-DA及各代謝物相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)的分析，對有統(tǒng)計意義的代謝物進行進一步歸納。在相關(guān)系數(shù)圖(圖3)中，將每一個變量的loading值與其標準偏差的平方根值相乘后進行數(shù)據(jù)的回溯轉(zhuǎn)換。然后與相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)臨界值表進行比對，得到引起組間差異的代謝物。結(jié)果顯示，PCOS痰濕證組和正常對照組之間的血清代謝成分存在差異。見表1。PCOS痰濕證患者較健康人血清中降低的代謝物有1-甲基組氨酸、檸檬酸、乙醇、甘油磷酸膽堿、低密度脂蛋白L1、脂質(zhì)L6(P均＜0.05)，增加的有乙酰乙酸、極低密度脂蛋白L5、脂質(zhì)L7，乳酸、賴氨酸、N-乙酰糖蛋白、蘇氨酸(P均＜0.05)。

圖3　血清核磁共振氫譜的OPLS-DA評分圖(左圖)及組間比對得到的相應(yīng)系數(shù)(右圖)

3　討論

1-甲基組氨酸、檸檬酸、乙醇、甘油磷酸膽堿L1、脂質(zhì)L6較健康人低，乙酰乙酸、L5、脂質(zhì)L7、乳酸、賴氨酸、N-乙酰糖蛋白、蘇氨酸較健康人增加。提示以上13種代謝產(chǎn)物可能是PCOS痰濕證潛在的生物標志。其在PCOS痰濕證患者與正常對照組有統(tǒng)計學差異的血清代謝組分中，檸檬酸在PCOS痰濕證患者血清中的水平明顯低于正常人，作為三羧酸循環(huán)(TCA)的重要中間代謝產(chǎn)物和起始產(chǎn)物，檸檬酸水平的降低說明機體伴隨著TCA循環(huán)障礙。正常生理狀態(tài)下，葡萄糖在無氧情況下，經(jīng)糖酵解過

程分解成乳酸，并釋放少量能量，乳酸是這一糖酵解過程的最終產(chǎn)物。結(jié)果顯示PCOS痰濕證患者血清中乳酸含量較正常人高，說明在組織缺氧的狀態(tài)下，PCOS痰濕證患者體內(nèi)的糖酵解過程增強。此外，乳酸還是糖異生途徑的代謝中間產(chǎn)物，也是糖異生過程的主要原料。人在某些生理病理情況下，肌糖原可生成大量乳酸，過多的乳酸經(jīng)血液運到肝臟，再合成葡萄糖或糖原，可防止乳酸性酸中毒的發(fā)生。本實驗中PCOS痰濕證患者血清乳酸水平的升高也說明其糖異生過程可能受到抑制。乙酰乙酸是酮體代謝的中間產(chǎn)物，正常情況下血中僅含少量酮體，在饑餓、糖尿病、高脂低糖膳食時，酮體生成增加，超過肝外組織利用酮體的能力時，導(dǎo)致血中酮體含量異常升高，并可引起代謝性酸中毒，治療需糾正糖代謝紊亂，減少脂肪動員和酮體的生成。PCOS痰濕證患者血中乙酰乙酸升高說明其糖代謝緩慢，脂肪酸動員加強，這些表現(xiàn)與胰島素抵抗導(dǎo)致的糖代謝異常有潛在聯(lián)系。

表1　兩組間血清代謝物的OPLS-DA相關(guān)系數(shù)

在脂代謝方面，PCOS痰濕證患者血清中L5較正常人升高。極低密度脂蛋白的代謝受飲食、激素等很多因素的調(diào)節(jié)，有研究［5］表明極低密度脂蛋白血濃度升高是胰島素抵抗、脂代謝紊亂的主要特征，其升高與胰島素抵抗密切相關(guān)。胰島素是調(diào)節(jié)脂肪合成的主要激素，PCOS痰濕證患者的胰島素抵抗可致胰島素調(diào)節(jié)脂肪合成，造成極低密度脂蛋白的升高。低密度脂蛋白由極低密度脂蛋白轉(zhuǎn)化而來，是僅含apoB-100的脂蛋白，攜帶膽固醇最多，也是正常人空腹時血漿中主要的脂蛋白。低密度脂蛋白代謝主要通過與受體結(jié)合后進入肝或肝外細胞。低密度脂蛋白的受體是一糖蛋白，且功能目前尚不明確，該受體可特異識別并結(jié)合含apo-100或apoE的脂蛋白。本研究中PCOS痰濕證患者血清中水平的變化與之前研究不同，其原因可能是PCOS痰濕證患者的胰島素抵抗通過影響受體，加速在血中的清除速率，使其水平下降，這一推論有待于進一步深入研究。此外，相比正常人，PCOS痰濕證患者血清中脂質(zhì)水平的升高或降低進一步提示其脂代謝紊亂。研究［6］表明肥胖PCOS患者具有更明顯的脂代謝紊亂，可能與雄激素過多和胰島素抵抗有關(guān)。

在氨基酸代謝方面，本實驗發(fā)現(xiàn)1-甲基組氨酸在PCOS痰濕證患者血清中顯著降低，許多氨基酸的碳架是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，所以氨基酸含量的降低可能與三羧酸循環(huán)異常有關(guān)。氨基酸除能生成蛋白之外，也能通過脫氨基生成有機酸類物質(zhì)，這些物質(zhì)分解代謝后的產(chǎn)物以底物的形式參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生并提供能量。蘇氨酸分解后通過丙酮酸，進而生成乙酰輔酶A進入三羧酸循環(huán)。PCOS痰濕證患者血清蘇氨酸升高，說明其分解并生成乙酰輔酶A的過程受抑制，進一步提示三羧酸循環(huán)受損。Zhao等［7］也發(fā)現(xiàn)，PCOS患者伴隨顯著的三羧酸循環(huán)受損，并通過檸檬酸水平下降和血中蘇氨酸等氨基酸水平的升高得以反映。賴氨酸與羥賴氨酸、色氨酸的分解代謝共同經(jīng)α-酮己二酸脫羧基最后氧化成乙酰輔酶A進入三羧酸循環(huán)，這個過程發(fā)生的代謝異常統(tǒng)稱為賴氨酸代謝異常。PCOS痰濕證患者血清賴氨酸水平升高提示其代謝過程可能受到抑制，進而生成乙酰輔酶A減少，最終導(dǎo)致三羧酸循環(huán)障礙。另外，和其他生糖氨基酸一樣，賴氨酸也有較強的刺激胰島素分泌的作用，因此，PCOS痰濕證患者的高賴氨酸血癥可能是其高胰島素血癥的原因之一。

綜上所述，PCOS痰濕證患者血清代謝組分的變化和三羧酸循環(huán)、糖代謝、脂代謝和氨基酸代謝密切相關(guān)，主要表現(xiàn)為三羧酸循環(huán)障礙、糖代謝緩慢、脂肪動員加強。提示PCOS痰濕證患者存在顯著的糖脂代謝紊亂，胰島素抵抗可能與此有潛在聯(lián)系。

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收稿日期:( 2015-07-08)

通信作者簡介:劉家義(1952-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向為舌、脈、證及其相關(guān)性研究。E-mail: liujiayi0202@163.com

作者簡介:第一李修陽(1984-)，男，講師，主要研究方向為舌、脈、證及其相關(guān)性研究。E-mail: Jack092284@163.com

基金項目:國家自然科學基金資助項目(81273667);國家自然科學基金青年科學基金資助項目(81102560)。

文章編號:1002-266X(2015)37-0015-04

文獻標志碼:A

中圖分類號:R711.75

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.37.005