呂巖，吳楠，李雯娜，賈大林(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽110001)

KB-R7943對高脂飲食大鼠心肌離體缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

呂巖，吳楠，李雯娜，賈大林
(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽110001)

摘要:目的探討選擇性Na+/Ca2 +交換體反向轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑KB-R7943對高脂飲食大鼠心肌離體缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法大鼠心臟給予完全缺血30min，之后再灌注120min。其中正常飲食喂養(yǎng)大鼠12只為對照組(C組)，高膽固醇飲食喂養(yǎng)大鼠48只。缺血后高膽固醇飲食大鼠做如下處理: 12只不干預(yù)(高膽固醇對照組，HC組); 12只給予KB-R7943(KB組); 12只給予KB-R7943和ATP敏感性鉀通道阻滯劑格列本脲(KB + G 組); 12只僅給予格列本脲(G組)。通過血流動力學(xué)指標(biāo)評價(jià)心臟功能，2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色測量心肌梗死范圍，電鏡下觀察心肌超微結(jié)構(gòu)及TUNEL染色評價(jià)心肌細(xì)胞凋亡程度。結(jié)果高脂喂養(yǎng)后，大鼠血清TC、LDLC、HDL-C均升高。與HC組比較，其余各組HR均加快(P均＜0.05);與HC組再灌注5、30、120min比較，KB組左室發(fā)展壓、等容收縮期左室壓力上升的最大速率、等容舒張期左心室壓力下降的最大速率均升高(P均＜0.05)。各組再灌注30min內(nèi)的各指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。C組心肌梗死程度明顯低于HC組，KB組梗死程度最輕(P均＜0.05)。與C組比較，HC組TUNEL陽性心肌細(xì)胞所占百分比均高(P均＜0.05)，KB組明顯低于HC、KB + G組、G 組(P均＜0.05)。HC組、KB + G組及G組心肌纖維排列紊亂，Z線扭曲，肌帶長短不一。肌細(xì)胞核形狀不規(guī)則，核心內(nèi)異染色質(zhì)凝聚，核膜局部模糊。KB組少數(shù)肌絲灶性溶解，線粒體腫脹輕微，少許肌漿網(wǎng)擴(kuò)張。結(jié)論高膽固醇血癥可增加缺血心肌的損傷程度，但不影響心臟收縮功能; KB-R7943通過ATP敏感性鉀通阻滯劑減少高脂飲食大鼠缺血心肌壞死及細(xì)胞凋亡，從而減輕缺血再灌注損傷。

關(guān)鍵詞:缺血再灌注損傷;高脂血癥;細(xì)胞凋亡; Na+/Ca2 +交換體反向轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑;大鼠

心肌缺血再灌注(I/R)后Na+/Ca2 +交換體(NCX)反向轉(zhuǎn)運(yùn)的激活加重鈣超載是心肌I/R損傷的重要機(jī)制［1］，通過抑制NCX來減輕I/R時(shí)的鈣超載是減輕I/R的有效途徑。KB-R7943是一種新型的NCX反向轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑。既往一些研究證實(shí)，KB-R7943能夠減少心肌缺血后酶的釋放［2，3］，減輕心肌梗死程度以及致命性的再灌注損傷［4～6］，模擬缺血后處理的作用。但在高脂條件下它是否還能發(fā)揮這樣的作用仍未見有研究證實(shí)。2013年1月～2014年4月，我們對此進(jìn)行了相關(guān)探討?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1材料60只Wistar雄性大鼠，4周齡，體質(zhì)量90～100 g，飲食良好，均由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部提供，按照美國國立衛(wèi)生研究院《實(shí)驗(yàn)動物管理與使用指南》［7］標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)。主要試劑及儀器: HDL、LDL檢測試劑盒(邁克科技有限公司，四川)，TC酶法試劑盒(BHKD，北京)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(Sigma，美國)，TUNEL反應(yīng)混合液(Calbiochem，美國)，KB-R7943(TOCRIS，英國)，格列本脲(Sigma，美國)。Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)(PL3508B2，埃德儀器國際貿(mào)易公司)，BIOPACmP150生理記錄儀(Biopac公司，美國)，透射電鏡(JEM-1200EX，日本)。

1.2動物分組及I/R損傷高脂動物模型制備60 只Wistar雄性大鼠中，12只正常飼養(yǎng)(普通飼料喂養(yǎng)8周，體質(zhì)量300～350 g)(C組)。另外48只給予高脂飲食(高脂飼料喂養(yǎng)8周，體質(zhì)量350～450 g)，平均分為高膽固醇對照組(HC組)、KB-R7943 組(KB組)、KB-R7943和ATP敏感性鉀通道(KATP)阻滯劑格列本脲組(KB + G組)、格列本脲組(G組)。全部大鼠心臟給予30min完全缺血，之后再灌注120min，高脂喂養(yǎng)的各組大鼠分別給予后處理: HC組單純?nèi)毖笤俟嘧? KB組缺血后再灌注前加入1 μmol/L KB-R7943; KB + G組缺血后再灌注前加入1 μmol/L KB-R7943 +0.3 μmol/L格列

本脲; G組缺血后再灌注前給予格列本脲0.3 μmol/ L再灌注。I/R高脂動物模型制備過程:經(jīng)尾靜脈給予肝素200 U，腹腔注射致死量(100mg/kg)的苯巴比妥麻醉大鼠，迅速分離心臟并置于肝素化的KH液中。將心臟懸掛于Langendorff灌流裝置上，經(jīng)主動脈逆行插管，37℃恒溫、流量1.5 L/min的95% O2/5% CO2充分飽和、37℃恒溫的K-H液灌流，心臟置于37℃恒溫瓶中，剪去左心耳，左室置入注水球囊測定灌流壓力，保持其為75mmHg，球囊充水，連接壓力傳感器。20min后待左室壓力及灌流量穩(wěn)定，進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.3大鼠血脂、血流動力學(xué)指標(biāo)的測定分別于喂養(yǎng)前及取心臟前采血，用酶法測TC，PTA-Mg2 +沉淀法測HDL-C、LDL-C。血流動力學(xué)指標(biāo)包括:心率(HR)、等容收縮期左心室壓力上升的最大速率(+dp/dt)、等容舒張期左心室壓力下降的最大速率(－dp/dt)、左心室發(fā)展壓(LVDP)，通過BIOPACmP150生理記錄儀進(jìn)行分析。

1.4大鼠心肌梗死程度、細(xì)胞凋亡程度的觀察每組選3只大鼠，將左心室切片進(jìn)行TTC染色。計(jì)算未染色部分質(zhì)量占左室總質(zhì)量的百分比。每組選3只大鼠心臟組織制作石蠟切片，每只隨機(jī)選取3張切片進(jìn)行TUNEL染色，光鏡下分析結(jié)果。每張切片在顯微鏡下選10個(gè)區(qū)域，計(jì)算每個(gè)區(qū)域的總細(xì)胞數(shù)及TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)。

1.5大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)觀察每組選取3只大鼠，取其心臟，左室負(fù)染色法染色后通過透射電鏡觀察心肌纖維及線粒體結(jié)構(gòu)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，高脂喂養(yǎng)大鼠喂養(yǎng)前后血脂的比較采用配對t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析;計(jì)數(shù)資料以百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1高脂喂養(yǎng)前后大鼠血清TC、LDL-C、HDL-C水平比較高脂喂養(yǎng)前TC、HDL-C、LDL-C分別為(68.6±10.5)、(47.6±7.2)、(13.7±0.5)mg，高脂喂養(yǎng)后分別為(106.1±3.6)、(55.8±13.0)、(25.2±1.3)mg。高脂喂養(yǎng)前后比較，P均＜0.05。

2.2各組血流動力學(xué)指標(biāo)比較見表1。

2.3各組心肌梗死范圍比較C組、HC組、KB組、KB + G組、G組心肌梗死范圍分別為(35.0± 5.0)%、(46.0±8.7)%、(28.6±3.3)%、(42.8± 5.1)%、(47.0±8.5)%。與C組比較，HC組心肌梗死范圍大、KB組心肌梗死范圍小;與HC組比較，KB組心肌梗死范圍小(P均＜0.05)。

表1　各組血流動力學(xué)指標(biāo)比較()

表1　各組血流動力學(xué)指標(biāo)比較()

注:與HC組同時(shí)間比較，*P＜0.05;與其他組同時(shí)間比較，#P＜0.05。

組別　n　HR LVDP(mmHg)+dp/dt　?。璬p/dt C組33±4.3 1 284±114 1 179±134 12基線　183±23 86±6.4 2 322±233 1 416±222再灌注5min　170±14 34±5.4 1 589±103 1 178±178再灌注30min　174±19 38±5.1 1 622±208 1 222±117再灌注120min　160±18 34±3.2 1 362±198 1 238±156 KB組　12基線　175±12 83±6.6 2 472±274 1 408±190再灌注5min　176±22 45±7.9*1 946±202*1 689±312*再灌注30min　178±27 47±6.0*2 066±287*1 608±202*再灌注120min　158±22 40±3.4*1 754±203*1 556±234*KB +G組　12基線　160±18 88±7.5 2 231±262 1 400±156再灌注5min　148±16 31±8.4 1 489±301 1 176±232再灌注30min　146±12 34±5.7 1 584±211 1 298±345再灌注120min　126±17 30±4.9 1 335±158 1 278±198 G組　12基線　155±16 84±6.9 2 330±198 1 401±165再灌注5min　155±12 34±6.7 1 476±225 1 188±198再灌注30min　160±15 39±4.2 1 601±201 1 274±237再灌注120min　126±21 34±3.4 1 378±167 1 256±159 HC組　12基線　157±20#82±7.3 2 318±187 1 378±107再灌注5min　148±15#32±7.7 1 466±259 1 109±167再灌注30min　155±23#38±6.5 1 589±217 1 271±189再灌注120min　125±26#

2.4各組心肌細(xì)胞凋亡程度比較C組、HC組、KB組、KB + G組、G組TUNEL陽性心肌細(xì)胞所占百分比分別為(7.1±1.4)%、(14.8±3.0)%、(5.4±1.5)%、(13.1±1.7)%、(13.9±1.5)%，與C組比較，HC組、KB + G組、G組均高(P均＜0.05);與HC組比較，KB組低(P均＜0.05)。

2.5各組心肌超微結(jié)構(gòu)比較C組心肌細(xì)胞可見心肌纖維排列不規(guī)則，部分有斷裂、缺如，Z線扭曲，肌節(jié)長短不一，肌細(xì)胞腫脹。KB + G組、G組、HC組心肌纖維排列紊亂，Z線扭曲，肌節(jié)長短不一。肌細(xì)胞核形狀不規(guī)則，核內(nèi)異染色質(zhì)凝聚、邊集，核膜局部模糊。相鄰肌纖維間多數(shù)線粒體嵴減少明顯或近空泡化。KB組肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，肌節(jié)清楚，少數(shù)肌絲灶性溶解，心肌纖維排列較整齊，部分有斷裂、缺如，Z線、M線清晰，相鄰肌纖維間有較多的線粒體，線粒體基質(zhì)密度較高。

3　討論

心肌梗死是指局部心肌急性供血不足導(dǎo)致心肌組織壞死，是發(fā)達(dá)國家中最主要致死性疾病。發(fā)生急性心肌缺血后盡早恢復(fù)缺血區(qū)的血液灌注是阻止心肌細(xì)胞死亡的最有效途徑，然而心肌缺血后再灌

注本身會加重缺血后心肌細(xì)胞損傷，即發(fā)生I/R損傷。引起心肌I/R損傷機(jī)制的相關(guān)研究有很多，目前比較公認(rèn)的機(jī)制有氧自由基的激活、鈣超載、細(xì)胞能量代謝障礙、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常、細(xì)胞凋亡以及NO合成和釋放減少，如何針對這些I/R后出現(xiàn)的心肌損害因素做出相應(yīng)的處理來減少甚至消除I/R損傷是目前研究的熱點(diǎn)問題，但迄今為止仍沒有能夠應(yīng)用于臨床的切實(shí)有效減輕I/R損傷的方法或藥物。有報(bào)道顯示，飲食所致的高脂血癥能夠通過增加氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、血管阻塞、細(xì)胞凋亡及抑制NO合成來加重心肌損傷;但也有部分研究報(bào)道，高脂血癥對心肌I/R損傷有保護(hù)作用［8，9］。

目前針對高脂動物模型心肌I/R損傷的研究存在很多爭議，造成這些不同結(jié)論的原因很多，如持續(xù)缺血時(shí)間、年齡、性別、種屬不同等。本研究中HC組心肌梗死程度增加，HR減低，但各組再灌注30min內(nèi)的+dp/dt、-dp/dt、LVDP無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示高脂血癥并不影響心肌收縮功能，這與既往的研究［10］結(jié)果相同。

心肌I/R損傷中心肌細(xì)胞鈣超載是重要的機(jī)制，而心肌細(xì)胞NCX在鈣超載的發(fā)生發(fā)展中起了至關(guān)重要作用。在I/R時(shí)，Ca2 +通過NCX反向轉(zhuǎn)運(yùn)的激活進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)是鈣超載的重要途徑［11］。KBR7943是一種選擇性NCX反向轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑，能夠通過抑制Ca2 +內(nèi)流減輕胞質(zhì)和線粒體內(nèi)鈣超載，減少心肌細(xì)胞壞死。在本研究中KB組心肌梗死范圍較HC組明顯降低，證實(shí)KB-R7943在高脂條件下有減輕心肌壞死的作用。

在I/R的信號通路中，表面受體、線粒體KATP、自由基、蛋白激酶C起著關(guān)鍵作用。正常條件下，KATP通道處于關(guān)閉失活狀態(tài)。心肌缺血時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ATP濃度下降，缺血代謝產(chǎn)物(ADP、乳酸、H+)積聚，KATP通道開放，導(dǎo)致K+外向復(fù)極電流增加，細(xì)胞膜通透性增加，心肌細(xì)胞動作電位時(shí)程縮短，電壓依賴性鈣電流及心肌收縮力減弱，減少了ATP的消耗，在心肌缺血時(shí)發(fā)揮保護(hù)作用［12，13］。KB-R7943可以減少心肌缺血后的梗死程度，而格列本脲能夠消除KB-R7943的這種保護(hù)作用，提示KATP通道在其心肌保護(hù)作用中發(fā)揮重要作用。我們前期研究［6］也證實(shí)NCX抑制劑與KATP通道開放劑合用能夠進(jìn)一步縮小心肌梗死范圍，這種作用可能是進(jìn)一步激活了線粒體KATP通道實(shí)現(xiàn)的。

總之，飲食誘導(dǎo)的高膽固醇血癥增加缺血心肌的損傷程度，但不影響心臟收縮功能，增加細(xì)胞凋亡是其加重心肌I/R損傷的途徑之一，選擇性NCX反向轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑KB-R7943通過KATP通道減少高脂動物缺血心肌壞死及細(xì)胞的凋亡，從而減輕I/R損傷。本研究的不足之處在于Langendorff模型作為離體模型，脫離了體內(nèi)血漿蛋白、血細(xì)胞以及激素的影響，所以這些結(jié)果應(yīng)用于臨床尚需進(jìn)一步的在體研究證實(shí)。

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文章編號:1002-266X(2015)37-0026-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R542.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.37.008