馬 靜，李凱利，馬 麗

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·中醫(yī)·中西醫(yī)結(jié)合研究·

溫通活血乳膏對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠超氧化物歧化酶及丙二醛水平影響研究

馬 靜，李凱利，馬 麗

目的 探討溫通活血乳膏對糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)大鼠氧化應(yīng)激的作用機(jī)制。方法 2013年5—9月，選用8周齡雄性SD大鼠50只。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組10只和造模組40只；造模組大鼠飼養(yǎng)期間死去10只，將剩余大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、硫辛酸組、溫通活血乳膏組，各10只。制作DPN大鼠模型，硫辛酸組大鼠腹腔注射硫辛酸，溫通活血乳膏組大鼠涂抹溫通活血乳膏，正常對照組與模型組大鼠給予等量的基質(zhì)。檢測并比較各組大鼠甩尾時間、潛伏期及運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度(MNCV)、血清及坐骨神經(jīng)抗氧化指標(biāo)〔超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平〕，觀察坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果 模型組大鼠甩尾時間較正常對照組延長(P<0.05)；硫辛酸組和溫通活血乳膏組大鼠甩尾時間較模型組縮短(P<0.05)。模型組潛伏期較正常對照組延長(P<0.05)；溫通活血乳膏組潛伏期較模型組縮短(P<0.05)。模型組、硫辛酸組和溫通活血乳膏組MNCV較正常對照組縮短(P<0.05)；硫辛酸組和溫通活血乳膏組MNCV較模型組延長(P<0.05)。模型組、硫辛酸組和溫通活血乳膏組血清MDA較正常對照組升高(P<0.05)。模型組坐骨神經(jīng)SOD、MDA與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。硫辛酸組和溫通活血乳膏組坐骨神經(jīng)MDA較模型組降低(P<0.05)。模型組有髓神經(jīng)纖維髓鞘增寬，板層結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，神經(jīng)嚴(yán)重脫髓鞘，細(xì)胞器空泡樣變性；硫辛酸組、溫通活血乳膏組大鼠有髓神經(jīng)纖維髓鞘、板層結(jié)構(gòu)、施萬細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化較模型組減輕。結(jié)論 溫通活血乳膏局部用藥可以改善MNCV，減輕周圍神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能損傷，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)氧化還原間的失衡，從而達(dá)到治療DPN的作用。

糖尿病神經(jīng)病變；超氧化物歧化酶；丙二醛；溫通活血乳膏

馬靜，李凱利，馬麗.溫通活血乳膏對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠超氧化物歧化酶及丙二醛水平影響研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(21)：2584-2588.[www.chinagp.net]

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糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，初診2型糖尿病(T2DM)患者中DPN患者約占34.6%[1]。其臨床表現(xiàn)為對稱性疼痛、感覺異常、間歇性或持續(xù)性發(fā)作，可呈電擊樣、燒灼樣疼痛，靜止或夜間癥狀嚴(yán)重，出現(xiàn)難治性潰瘍，最終導(dǎo)致截肢。年齡、血糖、血壓、糖化血紅蛋白、血脂等因素均可影響DPN的發(fā)生與進(jìn)展。但DPN的發(fā)病機(jī)制尚未徹底闡明，因此尚無特異的治療措施與根治方案。溫通活血乳膏是根據(jù)多年臨床經(jīng)驗，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)病機(jī)制的研究，依據(jù)“久病多虛”“久病多瘀”的中醫(yī)理論，以溫經(jīng)通絡(luò)、活血散瘀、消腫止痛之法，主要用于治療消渴病引發(fā)痹癥的外用制劑。本實驗從氧化應(yīng)激的角度探討溫通活血乳膏改善DPN大鼠病變的機(jī)制，為臨床干預(yù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗大鼠 2013年5—9月，選用健康、清潔級體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(180～220 g)的8周齡雄性SD大鼠50只〔新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物研究中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(新)2011-0001，動物合格證號：SCXK-LAC2013-5-13〕。

1.2 實驗室藥品及設(shè)備 溫通活血乳膏由新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院藥劑室提供；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)由美國SIGMA公司提供；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 實驗分組 50只大鼠檢疫觀察2周，檢疫期結(jié)束第2天禁食不禁水12 h后剪尾取血，采用ACCU-CHEK血糖測定儀(瑞士羅氏診斷公司)測定基礎(chǔ)血糖，大鼠基礎(chǔ)血糖均合格(<6.0 mmol/L)，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組，正常對照組10只，腹腔注射1%枸櫞酸緩沖液(pH 4.2)；造模組40只，腹腔注射60 mg/kg STZ(溶于1%枸櫞酸緩沖液，pH 4.2)。72 h后大鼠剪尾取血，測定尾靜脈血糖水平，以血糖≥16.7 mmol/L作為糖尿病大鼠成模標(biāo)準(zhǔn)。成模的糖尿病大鼠(40只)繼續(xù)飼養(yǎng)11周，制成DPN大鼠模型[1]，期間死去10只大鼠。

采用隨機(jī)數(shù)字表法將成模的DPN大鼠(30只)分為3組，

本研究背景：

氧化應(yīng)激在糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)生發(fā)展中的作用是目前學(xué)者研究的熱點，而中醫(yī)藥對此研究甚少。

每組10只，分別為模型組、硫辛酸組、溫通活血乳膏組。硫辛酸組大鼠腹腔注射硫辛酸，25 mg/kg[2]；溫通活血乳膏組大鼠兩后肢剃毛(剃毛面積均為1.6 cm×1.6 cm)后涂抹溫通活血乳膏，0.4 g/只，并使用老鼠頸圈將頭部固定，4 h后使用溫水將溫通活血乳膏擦去。正常對照組與模型組大鼠兩后肢剃毛(剃毛面積均為1.6 cm×1.6 cm)后涂抹等量的基質(zhì)，方法同溫通活血乳膏組。連續(xù)給藥8周，1次/d。

實驗過程中，大鼠共死去16只，最終正常對照組10只，模型組8只，硫辛酸組8只，溫通活血乳膏組8只。本研究由新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所實驗動物倫理委員會審核通過。

1.4 研究方法

1.4.1 檢測甩尾時間 給藥后8周，將4～5 cm長的大鼠尾端浸入(52.5±0.5)℃的水中，測定鼠尾從浸入到完全離開水面的時間，即甩尾時間，連續(xù)測3次，2次間隔5 min，取平均值[3]。

1.4.2 檢測潛伏期及運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度(motor nerve conduction velocity，MNCV) 將大鼠麻醉，俯臥位固定。(1)計算潛伏期：刺激電極置于神經(jīng)干，記錄電極置于肌腹，參考電極置于肌腱；地線置于刺激電極和記錄電極之間。用單脈沖方波刺激，波寬0.1 ms，刺激強(qiáng)度1.5倍閾值，計算機(jī)記錄從刺激神經(jīng)開始到遠(yuǎn)端肌肉出現(xiàn)動作電位的時間，即潛伏期。在動物體表準(zhǔn)確測定刺激電極到記錄電極之間的距離。(2)計算MNCV：超強(qiáng)刺激神經(jīng)干遠(yuǎn)端和近端，在該神經(jīng)支配的肌肉上可記錄到2次復(fù)合肌肉動作電位(compound muscle action potential，CMAP)，測定其不同的潛伏期，用遠(yuǎn)端和近端之間的距離除以兩點間潛伏期差，即為MNCV。

1.4.3 檢測血清及坐骨神經(jīng)抗氧化指標(biāo)

1.4.3.1 檢測血清SOD、MDA水平 給藥后8周，眼內(nèi)眥靜脈取血，2 500 r/min離心10 min(離心半徑為64 mm)，取上清液，采用SOD、MDA測定試劑盒檢測SOD、MDA水平。

1.4.3.2 檢測坐骨神經(jīng)SOD、MDA水平 給藥后8周，取下坐骨神經(jīng)，加入0.9%氯化鈉溶液，制成5%的勻漿，2 500 r/min離心10 min(離心半徑為5 cm)，取上清液，再用0.9%氯化鈉溶液1∶1稀釋成2.5%組織勻漿后，按照SOD、MDA測定試劑盒說明書檢測SOD、MDA水平。

1.4.4 觀察坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu) 用戊二醛固定坐骨神經(jīng)，制作電鏡切片，觀察坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 甩尾時間比較 4組大鼠甩尾時間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。模型組大鼠甩尾時間較正常對照組延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；硫辛酸組和溫通活血乳膏組大鼠甩尾時間較模型組縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.2 潛伏期、MNCV比較 4組大鼠潛伏期、MNCV比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。模型組潛伏期較正常對照組延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；溫通活血乳膏組潛伏期較模型組縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。模型組、硫辛酸組和溫通活血乳膏組MNCV較正常對照組縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；硫辛酸組和溫通活血乳膏組MNCV較模型組延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

Table 1 Comparison of tail flick latency,latency and MNCV of rats among different groups

組別只數(shù)甩尾時間(s)潛伏期(ms)MNCV(m/s)正常對照組104.2±1.11.2±0.234.3±2.6模型組810.1±3.3a1.7±0.2a17.7±1.9a硫辛酸組86.2±1.2b1.5±0.323.7±3.8ab溫通活血乳膏組86.1±2.1b1.3±0.3b21.8±4.5abF/Z值20.063c6.81842.975P值<0.0010.001<0.001

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；c為Z值；MNCV=運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度

2.3 血清及坐骨神經(jīng)抗氧化指標(biāo)比較 4組大鼠血清SOD比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。4組大鼠血清MDA比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；模型組、硫辛酸組和溫通活血乳膏組血清MDA較正常對照組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。4組大鼠坐骨神經(jīng)SOD、MDA比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；模型組坐骨神經(jīng)SOD、MDA與正常

本研究創(chuàng)新點：

目前臨床尚無中藥外用乳膏治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的藥物，本研究旨在從氧化應(yīng)激角度及形態(tài)學(xué)角度探討溫通活血乳膏改善糖尿病周圍神經(jīng)病變的機(jī)制，為臨床及研制新藥制劑提供理論基礎(chǔ)。

對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；硫辛酸組和溫通活血乳膏組坐骨神經(jīng)MDA較模型組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

Table 2 Comparison of levels of antioxidant markers in serum and sciatic nerve of rats among different groups

組別只數(shù)血清SOD(U/ml) MDA(nmol/ml)坐骨神經(jīng)SOD(U/ml) MDA(nmol/ml)正常對照組10141.1±19.25.4±1.032.2±5.25.6±1.1模型組8123.8±11.57.9±1.9a24.8±1.6a7.5±1.5a硫辛酸組8124.4±13.76.7±0.9a30.0±5.65.5±1.2b溫通活血乳膏組8131.9±23.07.1±1.1a28.8±4.36.2±0.8bF/Z值1.9246.39911.833c5.109P值0.1470.0020.0080.006

注：與正常對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05；c為Z值；SOD=超氧化物歧化酶，MDA=丙二醛

2.4 坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)比較 正常對照組：有髓神經(jīng)纖維髓鞘致密、均勻，髓鞘板層呈同心圓狀排列，軸突內(nèi)神經(jīng)和神經(jīng)微管排列整齊，施萬細(xì)胞及無髓纖維均正常。模型組：有髓神經(jīng)纖維髓鞘增寬，結(jié)構(gòu)松散，排列紊亂，板層結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，神經(jīng)嚴(yán)重脫髓鞘，細(xì)胞器空泡樣變性。硫辛酸組：有髓神經(jīng)纖維髓鞘板層結(jié)構(gòu)出現(xiàn)低密度泡狀結(jié)構(gòu)，少量神經(jīng)表現(xiàn)脫髓鞘，施萬細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化不明顯。溫通活血乳膏組：有髓神經(jīng)纖維髓鞘板層結(jié)構(gòu)出現(xiàn)低密度泡狀結(jié)構(gòu)，神經(jīng)處于脫髓鞘的各期，施萬細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化不明顯(見圖1)。

3 討論

DPN是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥，是造成糖尿病足及截肢的主要原因。其發(fā)病原因尚未完全闡明，目前認(rèn)為氧化應(yīng)激與糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，而抗氧化劑已被用于糖尿病慢性并發(fā)癥的治療[4]。

通過閱讀古今文獻(xiàn)，結(jié)合大量DPN 患者的臨床觀察，認(rèn)為本病是消渴病日久，久病入絡(luò)而引起的神經(jīng)并發(fā)癥；溫通活血乳膏是根據(jù)多年臨床經(jīng)驗，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)病機(jī)制的研究，依據(jù)“久病多虛”“久病多瘀”的中醫(yī)理論，以溫經(jīng)通絡(luò)、活血散瘀、消腫止痛之法，主要用于治療消渴病引發(fā)痹癥的外用制劑[5]。有文獻(xiàn)報道，川芎、紅花、桂枝、白芷、地龍的提取物均有抗氧化作用[6-12]。本實驗從氧化應(yīng)激的角度，探討溫通活血乳膏改善DPN大鼠病變的機(jī)制。

注：A為空白對照組，B為模型組，C為硫辛酸組，D為溫通活血乳膏組

圖1 各組大鼠坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)(免疫組化染色，×10 000)

Figure 1 The sciatic nerve ultrastructure of different groups for rats

本研究結(jié)果顯示，模型組MNCV較正常對照組減慢，表明DPN大鼠模型造模成功。與模型組比較，硫辛酸組、溫通活血乳膏組MNCV增快，潛伏期、甩尾時間縮短，坐骨神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)明顯改善，說明溫通活血乳膏對DPN大鼠有治療作用。模型組大鼠坐骨神經(jīng)SOD水平較正常對照組下降，MDA水平較正常對照組升高，說明了氧化應(yīng)激的產(chǎn)生且在坐骨神經(jīng)組織中有所表現(xiàn)。硫辛酸組、溫通活血乳膏組坐骨神經(jīng)MDA水平較模型組降低，提示通過溫通活血乳膏的干預(yù)后，可降低坐骨神經(jīng)組織中MDA水平，證明溫通活血乳膏可以通過抗氧化還原作用降低脂質(zhì)過氧化，從而對DPN大鼠MNCV的減慢具有改善作用。透射電子顯微鏡觀察到，溫通活血乳膏組大鼠有髓神經(jīng)纖維髓鞘板層結(jié)構(gòu)、施萬細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化較模型組均減輕，證明溫通活血乳膏能減輕DPN大鼠周圍神經(jīng)損傷，延緩DPN進(jìn)程。

然而，慢性持續(xù)性高血糖會導(dǎo)致過高的糖化反應(yīng)和氧化應(yīng)激的形成[13]，溫通活血乳膏對DPN大鼠血糖無直接影響[14]，持續(xù)的高血糖使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，可能導(dǎo)致各項指標(biāo)的變化不明顯。中醫(yī)藥在DPN治療中缺乏大樣本量、長期前瞻性、回顧性研究的相關(guān)臨床研究，循證依據(jù)不充分。與中醫(yī)病因及辯證分型相對應(yīng)的動物模型沒有統(tǒng)一的構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)與模式，因此，構(gòu)建符合中醫(yī)病因/辨證分型、分期的動物模型，在探討中醫(yī)藥防治DPN研究中至關(guān)重要。另外，由于時間、經(jīng)費等原因，本研究尚存在觀察例數(shù)較少的局限性。今后需進(jìn)一步擴(kuò)大臨床觀察范圍，以獲得更有說服力的證據(jù)。

綜上所述，溫通活血乳膏局部用藥可以通過抗氧化應(yīng)激和調(diào)節(jié)氧化還原間的失衡而改善MNCV，減輕周圍神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能損傷，從而起到治療DPN的作用。

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(本文編輯：崔麗紅)

Effect of Wen-tong-huo-xue Cream on Levels of Superoxide Dismutase(SOD) and Methane Dicarboxylic Aldehyde(MDA) Among Rats With Diabetic Peripheral Neuropathy

MAJing,LIKai-li,MALi.

DepartmentofEndocrinology,XinjiangUygurAutonomousRegionHospitalofTraditionalChineseMedicine,Urumqi830000,China

Objective To observe the mechanism of the effect of Wen-tong-huo-xue cream on oxidative stress among rats with diabetic peripheral neuropathy(DPN).Methods 50 male SD rats of 8 weeks old were selected as study subjects from May to September in 2013.The rats were divided into normal control group (n=10) and building model group (n=40) by random number table method. 10 rats of building model group died during the study, and then the rest rats were equally divided into three groups: model group, lipoic acid group, and Wen-tong-huo-xue cream group by random number table method.Rats in lipoic acid group were injected intraperitoneally with lipoic acid,rats in Wen-tong-huo-xue cream group were bepainted with Wen-tong-huo-xue cream,rats in normal control group and model group were treated with the same amount of matrix.The tail flick latency,latency,motor nerve conduction velocity(MNCV),levels of antioxidant markers〔superoxide dismutase(SOD) and methane dicarboxylic aldehyde(MDA)〕 in serum and sciatic nerve were measured and compared among different groups of rats,the ultra microstructure of sciatic nerve was observed.Results The tail flick latency of rats in model group was significantly longer than that of rats in normal control group(P<0.05);while the tail flick latency of rats in Wen-tong-huo-xue cream group and lipoic acid group was significantly shorter than that of rats in model group,respectively(P<0.05).The latency of rats in model group was significantly longer than that of rats in normal control group(P<0.05);the latency of rats in Wen-tong-huo-xue cream group was significantly shorter than that of rats in model group(P<0.05).MNCV of rats in model group,lipoic acid group,and Wen-tong-huo-xue group was significantly shorter than that of rats in normal control group,respectively(allP<0.05);MNCV of rats in lipoic acid group and Wen-tong-huo-xue group was significantly longer than that of rats in model group,respectively(P<0.05).Serum level of MDA of rats in model group,lipoic acid group,and Wen-tong-huo-xue group was significantly higher than that of rats in normal control group,respectively(P<0.05).There were significant differences in levels of SOD and MDA in sciatic nerve between model group and normal control group(P<0.05).There was significant difference in sciatic nerve MDA level between lipoic acid group and model group(P<0.05),and there was significant difference in sciatic nerve MDA level between Wen-tong-huo-xue group and model group(P<0.05).Widened myelin sheath of spinal nerve,damaged lamellar structure,demyelination of nerves,and organelle vesicular degeneration were found among rats in model group;the structural changes of myelin sheath of spinal nerve,lamellar structure,and Schwann cells among rats in Wen-tong-huo-xue cream group and lipoic acid group were slighter than those among rats in model group.Conclusion Wen-tong-huo-xue cream can improve MNCV,alleviate the injury of peripheral nerve structure and function,and its mechanism might be related to adjusting the imbalance between oxidation and reduction,so as to achieve the goal of treating DPN.

Diabetic neuropathies;Superoxide dismutase;Malondialdehyde;Wen-tong-huo-xue cream

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項目(2012211A095)

830000新疆烏魯木齊市，新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科

李凱利，830000新疆烏魯木齊市，新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科；E-mail：easd04lkl@126.com

R 587.29

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.21.020

2014-08-24；

2015-01-03)