項曉駿，陳紅波，葉黎青，馬紅珍

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·中醫(yī)·中西醫(yī)結(jié)合研究·

解毒祛瘀滋陰方聯(lián)合糖皮質(zhì)激素應(yīng)用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠的療效觀察及機制探討

項曉駿，陳紅波，葉黎青，馬紅珍

目的 探討解毒祛瘀滋陰方聯(lián)合糖皮質(zhì)激素應(yīng)用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠的療效和機制。方法 2012年4月—2014年5月選取60只MRL/lpr小鼠采用隨機數(shù)字表法分為3組，模型組20只，西藥組20只，聯(lián)合組20只；同時選取20只健康昆明小鼠作為空白對照組?？瞻讓φ战M和模型組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃；西藥組給予0.5 g/ml潑尼松混懸液灌胃；聯(lián)合組給予1.0 g/ml潑尼松混懸液聯(lián)合解毒祛瘀滋陰湯劑。比較各組小鼠的死亡率、外周血淋巴細(xì)胞(PBLC)凋亡率、皮質(zhì)醇水平和糖皮質(zhì)激素受體(GR)mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 干預(yù)12周后，空白對照組、模型組、西藥組、聯(lián)合組小鼠分別死亡0只、11只(55%)、7只(35%)、3只(15%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.237，P<0.05)。培養(yǎng)24 h和48 h時，模型組和西藥組PBLC凋亡率低于空白對照組(P<0.05)；西藥組和聯(lián)合組高于模型組(P<0.05)；聯(lián)合組高于西藥組(P<0.05)。各組小鼠皮質(zhì)醇水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中西藥組和聯(lián)合組高于空白對照組和模型組(P<0.05)；聯(lián)合組低于西藥組(P<0.05)。各組小鼠GRα mRNA和GRβ mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中模型組、西藥組和聯(lián)合組低于空白對照組(P<0.05)；西藥組和聯(lián)合組低于模型組(P<0.05)；聯(lián)合組高于西藥組(P<0.05)。結(jié)論 解毒祛瘀滋陰方聯(lián)合糖皮質(zhì)激素應(yīng)用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠可改善其死亡情況，療效優(yōu)于西藥單獨應(yīng)用，機制可能與降低皮質(zhì)醇水平、升高GR mRNA表達(dá)水平有關(guān)。

紅斑狼瘡,系統(tǒng)性；解毒劑(中藥)；祛瘀；滋陰；方劑；糖皮質(zhì)激素類；小鼠

項曉駿，陳紅波，葉黎青，等.解毒祛瘀滋陰方聯(lián)合糖皮質(zhì)激素應(yīng)用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠的療效觀察及機制探討[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(21)：2589-2593.[www.chinagp.net]

Xiang XJ，Chen HB，Ye LQ，et al.Curative effect and mechanism of Jieduquyuziyinfang combined with glucocorticoid in treatment of mice with systemic lupus erythematosus[J].Chinese General Practice，2015，18(21)：2589-2593.

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種可以累及全身多臟器的自身免疫性炎性結(jié)締組織疾病，多發(fā)于青年女性[1]。其發(fā)病機制與多種因素有關(guān)，致病因素共同作用導(dǎo)致淋巴細(xì)胞凋亡受阻，產(chǎn)生大量自身抗體，抗原-抗體結(jié)合物沉積在皮膚、關(guān)節(jié)、小血管、腎小球等部位，引起慢性炎癥及組織損傷[2-3]。糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid)是治療不同階段、不同類型SLE的首選藥物，但長期應(yīng)用可導(dǎo)致多種不良反應(yīng)，部分患者可能出現(xiàn)耐藥性[4]。本研究選取60只MRL/lpr小鼠作為觀察對象，研究解毒祛瘀滋陰方聯(lián)合糖皮質(zhì)激素應(yīng)用于SLE小鼠的療效和機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2012年4月—2014年5月選取60只雌性MRL/lpr小鼠，7～8周齡；體質(zhì)量19～23 g，平均(20.4±1.2)g；20只雌性健康昆明小鼠，7～8周齡；體質(zhì)量20～23 g，平均(20.9±0.8)g，均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。小鼠在實驗前均在SPF動物房中進(jìn)行4周隔離培養(yǎng)。

1.2 藥品 解毒祛瘀滋陰方(蚤休15 g、鱉甲12 g、青蒿30 g、白花蛇舌草30 g、赤芍12 g、積雪草12 g、升麻12 g、生地18 g、制首烏15 g等12味中藥)由浙江省中醫(yī)院中醫(yī)科自行配制，用水煎至含藥濃度為1.0 g/ml的湯劑；醋酸潑尼松片(天津力士制藥股份有限公司，批號：1006040)用0.9%氯化鈉溶液配制成0.5 g/ml 和1.0 g/ml的混懸液。

1.3 主要試劑和儀器 試劑：小鼠淋巴細(xì)胞分離液(美國MP Biomedicals公司)，Annexin V凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)，皮質(zhì)醇酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海通蔚實業(yè)有限公司)，RNA提取試劑盒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，糖皮質(zhì)激素受體(GR)mRNA(廣州歐譜生物科技有限公司)，其他生化試劑均購自生興生物技術(shù)(南京)有限公司。儀器：二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(常州恒德儀器制造有限公司)，流式細(xì)胞儀(山東萊索科技有限公司)，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(杭州晶格科學(xué)儀器有限公司)。

本研究創(chuàng)新點：

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種可以累及全身多臟器的自身免疫性炎性結(jié)締組織疾病，目前，臨床上糖皮質(zhì)激素是治療不同階段、不同類型SLE的首選藥物，但長期應(yīng)用可導(dǎo)致多種不良反應(yīng)，部分患者可能出現(xiàn)耐藥性并加大用藥劑量，導(dǎo)致惡性循環(huán)。目前，中西醫(yī)臨床上對于這一問題尚缺乏有效的解決方案。而根據(jù)中醫(yī)理論，SLE常表現(xiàn)為熱毒內(nèi)盛，耗傷腎陰致陰血虧虛，熱盛陰虧易致瘀血，糖皮質(zhì)激素屬陽熱之品，應(yīng)用后更致陰液耗傷，而解毒祛瘀滋陰方具有清熱解毒、活血化瘀和滋陰養(yǎng)腎的功效，可以有效緩解SLE癥狀。本研究通過中西醫(yī)結(jié)合的方式，將中醫(yī)傳統(tǒng)方劑解毒祛瘀滋陰方與經(jīng)典用藥糖皮質(zhì)激素聯(lián)合應(yīng)用，探討解毒祛瘀滋陰方在改善糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的耐藥性中的應(yīng)用價值。

1.4 方法

1.4.1 小鼠分組和藥物處理 20只健康昆明小鼠作為空白對照組，采用0.9%氯化鈉溶液灌胃，0.5 ml/d；將60只MRL/lpr小鼠采用隨機數(shù)字表法分為3組，模型組20只，采用0.9%氯化鈉溶液灌胃，0.5ml/d；西藥組20只，采用0.5 g/ml潑尼松混懸液灌胃，0.5 ml/d；聯(lián)合組20只，采用1.0 g/ml潑尼松混懸液灌胃，0.25 ml/d，同時聯(lián)合解毒祛瘀滋陰湯劑，0.25 ml/d。均飼養(yǎng)12周。

1.4.2 外周血淋巴細(xì)胞(PBLC)凋亡率檢測 (1)PBLC的分離和培養(yǎng)：在無菌室內(nèi)經(jīng)尾靜脈注射10%烏拉坦(1.5 ml/kg)麻醉小鼠，打開小鼠的胸腹腔，經(jīng)心臟取血5 ml。取小鼠肝臟備用。將1.5 ml血液、2 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)和2 ml淋巴細(xì)胞分離液加入8 ml離心管中，混勻后在4 ℃離心機中以2 500 r/min(離心半徑3.0 cm)離心20 min，小心吸取血液和分離液之間的淋巴細(xì)胞懸液，并移入EP管中，4 ℃，1 000 r/min(離心半徑3.0 cm)離心5 min，棄上清液；加入500 μl PBS，4 ℃ 1 000 r/min(離心半徑3.0 cm)離心5 min，取上清液后加入PBS制備淋巴細(xì)胞混懸液，細(xì)胞濃度為1×106個/L。將制備好的混懸液加入24孔板中，在37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。分別收取培養(yǎng)0、24、48 h的細(xì)胞懸液進(jìn)行檢測。(2)流式細(xì)胞儀檢測PBLC凋亡率：將上述單細(xì)胞懸液以1 000 r/min(離心半徑3.0 cm)離心5 min，PBS洗滌細(xì)胞后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109個/L。在細(xì)胞懸液中加入經(jīng)過預(yù)冷的結(jié)合緩沖液、5×10-6/L的Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)液和10×10-6/L的PI液，混勻后于室溫下避光放置15 min后用流式細(xì)胞儀檢測PBLC凋亡率。

1.4.3 小鼠皮質(zhì)醇水平檢測 將2 ml血液樣本(無菌，心臟取血)加入離心管中，4 ℃ 3 000 r/min(離心半徑3.0 cm)離心10 min,取上清液，應(yīng)用皮質(zhì)醇ELISA試劑盒檢測血清中的皮質(zhì)醇水平。

1.4.4 小鼠GR mRNA表達(dá)水平檢測 采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測小鼠GR mRNA，取小鼠肝組織100 mg,剪碎后用2.5%胰蛋白酶進(jìn)行消化，制備單細(xì)胞懸液，1 000 r/min(離心半徑3.0 cm)離心5 min。應(yīng)用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞的mRNA，所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。選取甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參，對內(nèi)參和目標(biāo)基因的mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA。將cDNA進(jìn)行擴增，反應(yīng)體系為25 μl。反應(yīng)條件：94 ℃變性5 min，94 ℃ 1 min，5 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，順序循環(huán)35次，72℃延伸5 min，產(chǎn)物于4 ℃保存。運用瓊脂糖凝膠電泳檢測各組小鼠的GRα mRNA和GRβ mRNA表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠死亡率比較 干預(yù)12周后，空白對照組無小鼠死亡，模型組11只(55%)小鼠死亡，西藥組7只(35%)小鼠死亡，聯(lián)合組3只(15%)小鼠死亡，各組小鼠死亡率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.237，P<0.05)。

2.2 各組小鼠不同時間PBLC凋亡率比較 培養(yǎng)0 h時，4組間PBLC凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；培養(yǎng)24 h和48 h時，4組間PBLC凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。培養(yǎng)24 h和48 h時，模型組和西藥組PBLC凋亡率低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；西藥組和聯(lián)合組高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合組高于西藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.3 各組小鼠皮質(zhì)醇水平比較 各組小鼠皮質(zhì)醇水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中西藥組和聯(lián)合組高于空

白對照組和模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合組低于西藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

Table 1 Comparison of PBLC apoptosis rates of mice among different groups at different time points

組別只數(shù)PBLC凋亡率0h 24h 48h空白對照組203.77±1.2413.85±2.6425.97±4.35模型組92.18±0.893.76±1.02a5.17±1.81a西藥組134.52±1.698.94±1.89ab17.85±3.17ab聯(lián)合組174.31±1.4711.97±2.06bc24.35±3.99bcF值2.1795.1786.980P值0.1260.0370.025

注：PBLC=外周血淋巴細(xì)胞；與空白對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與西藥組比較，cP<0.05

表2 各組小鼠皮質(zhì)醇水平比較

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與西藥組比較，cP<0.05

2.4 各組小鼠GRα mRNA和GRβ mRNA表達(dá)水平比較 各組小鼠GRα mRNA和GRβ mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中模型組、西藥組和聯(lián)合組低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；西藥組和聯(lián)合組低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合組高于西藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖1、表3)。

注：A為空白對照組，B為模型組，C為西藥組，D為聯(lián)合組

圖1 各組小鼠GRα mRNA和GRβ mRNA表達(dá)水平

Figure 1 Expression levels of GRα mRNA and GRβ mRNA of mice among different groups

Table 3 Comparison of expression levels of GRα mRNA and GRβ mRNA of mice among different groups

組別只數(shù)GRαmRNAGRβmRNA空白對照組200.651±0.0850.271±0.035模型組90.476±0.062a0.132±0.017a西藥組130.252±0.024ab0.072±0.009ab聯(lián)合組170.355±0.051abc0.110±0.012abcF值6.3436.892P值0.0310.028

注：GR=糖皮質(zhì)激素受體；與空白對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與西藥組比較，cP<0.05

3 討論

SLE是一種較為常見的自身免疫性的炎癥性結(jié)締組織疾病，多發(fā)于育齡女性，可累及全身多個器官和組織[5]。SLE患者的淋巴細(xì)胞凋亡受阻，產(chǎn)生大量自身抗體，形成的免疫復(fù)合物沉積在不同組織，在補體的作用下引起組織損傷[6]。目前，糖皮質(zhì)激素是治療SLE的首選藥物，藥物作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是糖皮質(zhì)激素與GR的結(jié)合，從而發(fā)揮藥理作用，調(diào)節(jié)機體的免疫功能[7]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素的長期應(yīng)用不僅可以導(dǎo)致多種不良反應(yīng)的發(fā)生，部分患者還可以出現(xiàn)耐藥性，這可能與細(xì)胞GR表達(dá)水平的下降有關(guān)[8]。

MRL/lpr小鼠的Fas 基因出現(xiàn)凋亡相關(guān)突變，淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞存在凋亡缺陷，T細(xì)胞過度增生，從而產(chǎn)生大量的類風(fēng)濕相關(guān)的因子，因此MRL/lpr小鼠是研究SLE較為理想的動物模型[9]。本研究選取60只MRL/lpr小鼠作為觀察對象，同時選取20只健康昆明小鼠作為空白對照組，研究解毒祛瘀滋陰方聯(lián)合糖皮質(zhì)激素應(yīng)用于SLE小鼠的療效和機制。經(jīng)過12周的干預(yù)后，模型組11只小鼠死亡，西藥組7只，高于空白對照組；聯(lián)合組3只小鼠死亡，低于模型組和西藥組。分離并培養(yǎng)小鼠的外周血淋巴細(xì)胞，比較各組小鼠PBLC凋亡率，24 h和48 h時有差異：模型組小鼠PBLC凋亡率低于空白對照組，說明MRL/lpr小鼠存在淋巴細(xì)胞凋亡障礙；西藥組小鼠PBLC凋亡率高于模型組，說明糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用可以促進(jìn)PBLC的凋亡并降低小鼠的死亡率；聯(lián)合組小鼠PBLC凋亡率高于西藥組，且與空白對照組無統(tǒng)計學(xué)差異，小鼠死亡率較低，故解毒祛瘀滋陰方聯(lián)合糖皮質(zhì)激素治療SLE的療效優(yōu)于單純應(yīng)用糖皮質(zhì)激素[10]。

各組小鼠的皮質(zhì)醇水平可以反映小鼠應(yīng)用糖皮質(zhì)激素后的血清藥物濃度[11]，模型組小鼠和空白對照組小鼠的皮質(zhì)醇水平無統(tǒng)計學(xué)差異，與上述兩組小鼠相比，西藥組和聯(lián)合組小鼠皮質(zhì)醇水平升高，聯(lián)合組小鼠皮質(zhì)醇水平低于西藥組。研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素治療SLE的療效取決于藥物與GR的結(jié)合，而長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素可以下調(diào)GR水平，其機制較為復(fù)雜，主要從mRNA水平抑制GR表達(dá)[12]。與空白對照組小鼠相比，模型組小鼠的GRα mRNA和GRβ mRNA表達(dá)水平下降，西藥組小鼠的GR mRNA表達(dá)水平低于模型組，說明糖皮質(zhì)激素可以通過下調(diào)GR表達(dá)水平誘導(dǎo)耐藥性[13]。與西藥組小鼠相比，聯(lián)合組小鼠的GRα mRNA和GRβ mRNA表達(dá)水平升高，說明解毒祛瘀滋陰方的應(yīng)用可以拮抗糖皮質(zhì)激素對GR表達(dá)的抑制作用；同時聯(lián)合治療可以降低小鼠的血清皮質(zhì)醇水平，減輕因為大量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素造成的不良反應(yīng)。

根據(jù)中醫(yī)理論，SLE常表現(xiàn)為熱毒內(nèi)盛，耗傷腎陰致陰血虧虛，熱盛陰虧易致瘀血；糖皮質(zhì)激素屬陽熱之品，應(yīng)用后更致陰液耗傷。解毒祛瘀滋陰方具有清熱解毒、活血化瘀和滋陰養(yǎng)腎的功效，可以有效緩解SLE癥狀。生地黃具有清熱涼血養(yǎng)陰的功效，配伍具有清熱解毒作用的白花蛇舌草、積雪草和升麻，赤芍活血散瘀，鱉甲、制首烏養(yǎng)陰益腎，蚤休調(diào)節(jié)免疫，青蒿退熱、梳理少陽氣機，諸藥成方后可以有效發(fā)揮清熱解毒和養(yǎng)陰的作用[14-15]。

綜上所述，解毒祛瘀滋陰方聯(lián)合糖皮質(zhì)激素對SLE的療效優(yōu)于西藥單獨應(yīng)用，其作用機制可能與GR的表達(dá)有關(guān)。本研究尚存在以下局限性：研究以小鼠為觀察對象，因?qū)嶒灢牧系闹萍s，研究持續(xù)12周，時間較短；實驗過程中，未根據(jù)各組小鼠有無耐藥情況調(diào)整糖皮質(zhì)激素的劑量，故難以明確解毒祛瘀滋陰方能否減少糖皮質(zhì)激素的用量；同時，本研究尚未明確解毒祛瘀滋陰方是否可以減輕SLE患者長期用藥的不良反應(yīng)。上述問題的解決寄希望于進(jìn)一步的動物實驗和未來臨床試驗的開展。

利益沖突聲明：本課題未涉及任何廠家及相關(guān)雇主或其他經(jīng)濟組織直接或間接的經(jīng)濟或利益贊助。無利益沖突。

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(本文編輯：陳素芳)

Curative Effect and Mechanism of Jieduquyuziyinfang Combined With Glucocorticoid in Treatment of Mice With Systemic Lupus Erythematosus

XIANGXiao-jun，CHENHong-bo，YELi-qing，etal.

DepartmentofNephrology,ZhejiangProvincialHospitalofTCM,Hangzhou310014,China

Objective To study the curative effect and mechanism of Jieduquyuziyinfang combined with glucocorticoid in treatment of mice with systemic lupus erythematosus.Methods 60 MRL/lpr mice were equally divided into 3 groups by random number table method:model group,western medicine group,and combined treatment group;20 healthy Kunming mice were chosen as blank control group from April 2012 to May 2014.Mice in blank control group and model group received intragastric administration of 0.9% sodium chloride solution;mice in western medicine group received intragastric administration of 0.5 g/ml metacortandracin suspension;mice in combined treatment group received intragastric administration of 1.0 g/ml metacortandracin suspension and Jieduquyuziyin decoction.The rate of death,rate of PBLC apoptosis,levels of CORT and GR mRNA were compared among different groups.Results 12 weeks after treatment,0 case in blank control group,11 cases(55%) in model group,7 cases(35%) in western medicine group and 3 cases(15%) in combined treatment group mice died,there were significant differences in the rate of death among different groups(χ2=5.237,P<0.05).24 h and 48 h after treatment,the rate of PBLC apoptosis in model group and western medicine group was significantly lower than that in blank control group,respectively;the rate of PBLC apoptosis in western medicine group and combined treatment group was significantly higher than that in model group(P<0.05);the rate of PBLC apoptosis in combined treatment group was significantly higher than that in western medicine group(P<0.05).There were significant differences in level of peripheral blood CORT among different groups of mice(P<0.05),level of peripheral blood CORT in western medicine group and combined treatment group was significantly higher than that in blank control group and model group,respectively(P<0.05);level of peripheral blood CORT in combined treatment group was significantly lower than that in western medicine group(P<0.05).There were significant differences in expression levels of GRα mRNA and GRβ mRNA among different groups of mice(P<0.05);expression levels of GRα mRNA and GRβ mRNA in model group,western medicine group and combined treatment group were significantly lower than those in blank control group,respectively(P<0.05);expression levels of GRα mRNA and GRβ mRNA in western medicine group and combined treatment group were significantly lower than those in model group,respectively(P<0.05);expression levels of GRα mRNA and GRβ mRNA in combined treatment group were significantly higher than those in western medicine group(P<0.05).Conclusion Jieduquyuziyinfang combined with glucocorticoid can reduce the rate of death among mice with systemic lupus erythematosus,the curative effect of which is better than that of western medicine,the mechanism may be related to the reduction effect of Jieduquyuziyinfang combined with glucocorticoid on CORT level and the enhancement effect of Jieduquyuziyinfang combined with glucocorticoid on GR mRNA expression level.

Lupus erythematosus,systemic；Antidotic agents(TCD)；Removing blood stasis；Nourishing yin；Chinese medical formula；Glucocorticoids；Mice

國家自然科學(xué)基金資助項目(81202673)

310014浙江省杭州市，浙江省中醫(yī)院腎內(nèi)科

項曉駿，310014浙江省杭州市，浙江省中醫(yī)院腎內(nèi)科；E-mail:xiangxiaojunzj@163.com

R 593.241

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.21.021

2014-12-08；

2015-03-23)