李永紅，周方方, 付路平，劉宏民#

1)鄭州大學(xué)新藥研究開(kāi)發(fā)中心 鄭州 450001　2)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001

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利斯的明中間體含量及ee值的RP-HPLC法測(cè)定*

李永紅1,2)，周方方2), 付路平2)，劉宏民1,2)#

1)鄭州大學(xué)新藥研究開(kāi)發(fā)中心 鄭州 4500012)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001

關(guān)鍵詞利斯的明；手性藥物中間體；ee值

摘要目的：建立RP-HPLC法測(cè)定生物轉(zhuǎn)化液中利斯的明中間體含量及ee值的方法。方法：以Lux 3u Cellulose-1為手性分離柱，以正己烷異丙醇(VV=92.57.5)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)217 nm，進(jìn)樣量20 μL。結(jié)果：中間體能夠完全分離，在測(cè)定中間體含量的同時(shí)能夠測(cè)定樣品的ee值。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、靈敏、精密度良好，適合生物轉(zhuǎn)化液中利斯的明中間體含量及ee值的測(cè)定。

AbstractAim: To establish a RP-HPLC method to determine the ee values and content of rivastigmine intermediates in bioconversion broth.Methods: The determination was performed on a Lux 3u Cellulose-1 column with a 92.57.5(VV) mixture of n-hexane and isopropanol alcohol as mobile phase, determination wavelength of 217 nm and injection volume of 20 μL.Results: The two intermediates were completely separated. The ee value could be determined as well as the determination of the content of the intermediates.Conclusion: The method is accurate and sensitive with high precision.It is suitable for the determination of the ee values and content of rivastigmine intermediates in bioconversion broth.

利斯的明可以選擇性地在大腦區(qū)域內(nèi)作用并有較長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間的活性，是氨基甲酸酯類乙酰膽堿酯酶抑制劑[1-2]。Enz等[3]通過(guò)HPLC-MS的方法測(cè)定了利斯的明的代謝產(chǎn)物在大鼠腦和血漿中的濃度。Pommier等[4]開(kāi)創(chuàng)了采用GC-MS測(cè)定人體血漿樣品中利斯的明濃度的方法。該研究建立了利用RP-HPLC測(cè)定生物轉(zhuǎn)化液中利斯的明中間體含量及ee值的方法。該方法快速、簡(jiǎn)單，且不受雜質(zhì)的影響，報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1儀器型號(hào)與試劑HYG-Ⅱa 型自動(dòng)搖瓶柜(上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司)，R-1005旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)，Waters 1525高效液相色譜儀，色譜柱為L(zhǎng)ux 3u Cellulose-1柱(4.6 mm×250 mm，美國(guó)Phenomenex公司)。菌種來(lái)源：鄭州大學(xué)藥學(xué)院篩選并保藏的一株能產(chǎn)生立體選擇性酯酶的菌種。正己烷為色譜純(天津康科德科技有限公司)，其他試劑為分析純。

參考文獻(xiàn)1.2樣品的拆分原理及制備[5-8]，作者篩選到一株能產(chǎn)生立體選擇性酯酶的菌株，用脂肪酶Novozym453轉(zhuǎn)化化合物2，以乙酸異丙烯酯為酰基供給體，得到中間體(R)-1和(S)-2。見(jiàn)圖1。

圖1　化合物2的轉(zhuǎn)化

具體制備步驟如下：將菌種轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基，于28 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)48 h后加入底物，同等條件下轉(zhuǎn)化12 h得到轉(zhuǎn)化液。合并用相同體積的乙酸乙酯萃取轉(zhuǎn)化液3次后的有機(jī)相；經(jīng)無(wú)水Na2SO4干燥后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，用相應(yīng)的流動(dòng)相溶解，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)后用于測(cè)定。

1.3色譜條件流動(dòng)相為V正己烷V異丙醇=92.57.5，流速0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為217 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

1.4色譜峰的歸屬轉(zhuǎn)化12 h后，分析轉(zhuǎn)化底物和產(chǎn)物的HPLC圖譜，并以此樣品圖譜與實(shí)驗(yàn)室保藏菌種轉(zhuǎn)化產(chǎn)品的HPLC圖譜對(duì)比，進(jìn)行色譜峰的歸屬。

1.5方法學(xué)分析

1.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[9-10]準(zhǔn)確稱量自制的化合物2[(R)-2為化合物2的R型異構(gòu)體]和化合物1各1.0 g，加異丙醇溶解并定容至100 mL，配成2種化合物質(zhì)量濃度均為10 g/L的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品。取適量上述混合樣品，用流動(dòng)相稀釋為質(zhì)量濃度分別為0.25、0.50、0.75、1.00、1.25和1.50 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3提供的條件測(cè)定并進(jìn)行線性回歸分析，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 精密度實(shí)驗(yàn)按照1.3方法，取一份轉(zhuǎn)化液進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)5次，記錄其峰面積并計(jì)算RSD值。

1.5.3加標(biāo)回收率在轉(zhuǎn)化液中加入不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品，按1.3方法測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.5.4樣品ee值的計(jì)算通過(guò)樣品2個(gè)異構(gòu)體的峰面積來(lái)計(jì)算ee值，ee=(R異構(gòu)體峰-S異構(gòu)體峰)/(S異構(gòu)體峰+R異構(gòu)體峰)×100%。

2結(jié)果

2.1化合物的分離效果用上述液相條件，在利斯的明中間體拆分過(guò)程中，化合物2和化合物1的分離效果比較理想。各個(gè)中間體名稱、結(jié)構(gòu)、色譜圖和分離結(jié)果見(jiàn)圖2。左：化合物2和化合物1混合物的HPLC圖譜；中：消旋的化合物2轉(zhuǎn)化12 h后轉(zhuǎn)化為(S)-2、(R)-1的HPLC圖譜；右：化合物2的HPLC圖譜。

圖2　相關(guān)中間體的結(jié)構(gòu)

從圖2可以看出，化合物1和化合物2可以被完全拆分，HPLC圖譜基線平穩(wěn)，轉(zhuǎn)化液經(jīng)處理后基本沒(méi)有雜質(zhì)。通過(guò)化合物1和化合物2混合物的HPLC譜圖、化合物2的HPLC圖譜及消旋化合物2轉(zhuǎn)化12 h后的HPLC圖譜結(jié)果對(duì)比分析可知，新出現(xiàn)的峰為化合物(R)-1的峰，轉(zhuǎn)化12 h后，化合物(S)-2的峰面積基本沒(méi)變，而化合物(R)-2的峰面積有所減少，且沒(méi)有(S)-1的峰出現(xiàn)?；衔?的(R)-異構(gòu)體和(S)-異構(gòu)體保留時(shí)間分別為(10.334±0.300) min和(12.037±0.300) min，化合物2的(S)-異構(gòu)體和(R)-異構(gòu)體保留時(shí)間分別為(14.618±0.200) min和(17.045±0.300) min，誤差在允許范圍內(nèi)。

2.2方法學(xué)分析結(jié)果2種化合物在0.25~1.25 g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好?；衔?的線性方程為Y=24 472X-74.767，R2=0.999 5，化合物1的線性方程為Y=21 961X+404.98，R2=0.999 3；該方法測(cè)定結(jié)果的精密度較好，RSD分別為1.190%(n=6)和1.850%(n=6)；化合物(R)-1的ee值為93.22%，化合物(R)-2的ee值為92.22%。化合物2和化合物1的加標(biāo)回收率分別為98.170%和98.830%。

表1　加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3討論

該實(shí)驗(yàn)所用的正己烷和異丙醇均為色譜純且樣品中沒(méi)有過(guò)多的雜質(zhì)，故HPLC譜圖基線平穩(wěn)，色譜峰之間沒(méi)有重疊，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。使用該方法不但使化合物1、2得到了良好的分離，而且各自的2種對(duì)映異構(gòu)體也基本上被分離，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不僅可同時(shí)測(cè)定2種化合物的含量，還可以測(cè)定其ee值，有利于對(duì)轉(zhuǎn)化過(guò)程進(jìn)行跟蹤測(cè)定，且靈敏度高。作者利用此分析方法已經(jīng)對(duì)季也蒙畢赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)HM988686.1催化利斯的明中間體拆分的轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，利用優(yōu)化后的條件進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化速度大大提高。

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*安徽中醫(yī)藥大學(xué)2014年自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目2014zr010

Determination ofeevalues and content of rivastigmine intermediates by RP-HPLC

LIYonghong1,2),ZHOUFangfang2),FULuping2),LIUHongmin1,2)

1)NewDrugResearch&DevelopmentCenter，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou4500012)DepartmentofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

Key wordsrivastigmine; chiral drug intermediate; ee value

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.018

中圖分類號(hào)TQ460.7

通信作者#，男，1960年3月生，博士，教授，研究方向：藥物化學(xué)及糖化學(xué)，E-mail：liuhm@zzu.edu.cn